200698. lajstromszámú szabadalom • Eljárás micellás részecskék stabilizálására
HU 200698 B vábbiakban a kereskedelemben kapható száraz, adott esetben poralakú gél-oldat, illetve gél előállítására alkalmas anyagokat gélképzőknek nevezzük. Micetíás részecskék készítése és terhelése Kis, unflamelláris részecskéket állítottunk elő és térhettünk Mauk és társai szerinti módszerrel (Mauk R.R. and Gamble R.C., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Iß, 765 /1979/). A módszer a következő volt: Lipid-elegyet, Chol-t és A23187-et 2:1:0,004 mólarányban elegyítettünk. A lipid elegyet éjszakán át szárítottuk vákuumban és utána ultrahanggal kezeltük foszfáttal pufferolt konyhasó-oldatban (PES, pH= 7,4), amely 1 mM NTA-t tartalmazott vagy másként specifikáltuk. A lipidfázis részére 14C- vagy Tl-koleszterm-oleátot használtunk jelzőanyagként. Ultrahanggal való kezelés, lágyítás és kis sebességgel való centrifugálás után a részecskéket elkülönítettük a felesleges NTA-tól oly módon, hogy a PBS-el egyensúlyban tartott Sephadex G-50 oszlopon engedtük át. A részecskéket ^InCb-mal terheltük oly módon, hogy a radionuclidot hozzáadtuk a készítményhez és 80 °C-on inkubáltuk 54 percig. Inkubálás után feleslegben EDTA-t adtunk a komplexhez, amely szabad mIn-t tartalmazott a részecske felületén vagy a lapban, ezután ezeket a szabad 111INEDTA komplexeket elkülönítettük a terhelt micellás részecsékéktől oszlopkromatográfiásan. Ehhez Sephadex G-50-nel töltött oszlopot használtunk. Dinamikus fényszóródás-mérések A részecske méretét dinamikus fényszóródással mérjük, amely a szóródás erősségében mutatkozó fluktuációk időbeli változásával függ össze, ahogy Frokjaer S., et al. leírták [Alfred Benzon Symp., 12, 384 /1982/J. Ahogy a részecskék folytonos Brownmozgást végeznek, a szóródás erőssége nagymértékben fluktuál nullától (teljes kioltó interferencia) egészen a legnagyobb hullámig (nincs interferencia). A szóródó részecskék diffúziós koefficiense arányban van a szóródás erősségében mutatkozó fluktuáció átlagos időtartamával. Általában minél nagyobbak a részecskék, annál lassúbb a diffúzió és annál hosszabb a fluktuáció átlagos időtartama. Szférikus részecskékre (így liposomákra) a diffúziós koefficiens (D) arányos hidrodinamikus rádiusszá! (rh) a Stokes-Einstein arány szerint: D - Kb T/6-yrh, ahol kb a Boltzmann-féle állandó, T az abszolút hőmérséklet és az oldószer viszkozitása. Valamely részecske szűrt PBS-sel készített híg szuszpenzióját vittük be átlátszó 6 x 50 mm-es kémcsövekbe. A fényszóródás-mérést NiComp model TC-200 számító autocollerator részecskemérővel végeztük. A készüléket egy 64 csatornás 4-bites autokorrelátorral és egy 5 mW-os halk He-Ne leserrel szereltük fel. A találmány szerinti eljárást a következőkben kiviteli példákon is bemutattuk. 1. példa Kis unilamelláris részecskéket (SUV) készítettünk a leírt módszer szerint, amelyek 2:1 mólarányban tartalmaztak DPSC-t és Cohl-t. Lipidjelzőanyagként 14C-koleszterin oleátot alkalmaztunk. 3 Ultrahanggal való kezelés, lágyítás és kis sebességgel való centrifugálás után a részecskéket összekevertük zselatinnal vagy agarose-val sterilizált üvegcsékben a következő véső koncentrációk beállítása végett: (1) 10 mg SUV/ml 1%-os zselatin-oldat; (2) 35 mg SUV/ml 1%-os zselatin-oldat vagy (3) 10 mg SUV/ml 1%-os agarose oldat. Az üvegcséket hűtőszekrényben tartottuk 4 °C-on. Az előállítás után különböző időpontokban különböző koncentrációjú mintákat vagy polimer közeget szobahőmérsékleten megolvasztottunk. Különböző mintákat készítettünk PBS-sel és a méreteket leser-fényszóródással mértük az előző fejezetben leüt módon. Az 1. ábrán láthatjuk, hogy a méret vltozatlan maradt akkor, ha a részecskéket zselatin vagy agarose beágyazóanyagban tároltuk, mígPBS-ben a részecskék öszszetömörültek (aggregálódtak) vagy megolvadtak rövid idővel az előállítás után. 2 példa Az előző példában láthattuk, hogy a részecske mérete valamely polimer beágyazóanyagban hosszú időn keresztül változatlan maradt. Áz is nagyon fontos azonban valamely gyógyszerkészítménynél, hogy a részecske megtartsa a bezárt anyagot megfelelő ideig. Ez a példa azt mutatja be, hogv a részecskébe bezárt anyag nem szivárog ki 1%-os zselatinos közegben 4 °C-on. 1 mM 14C-EDTA-t PBS-ben ultrahanggal kezeltünk DSPC-vel és Chol-lal (2:1) együtt, amelyet nyomokban jelenlévő ^H-koleszterin-oleáttal jelöltünk. A szabad bekapszulázatlan EDTA-t elkülönítettük a bezárt anyagtól Sephadex G-50 oszlopon való átbocsátás útján. A 14C-EDTA-t a SUV-ba kapszulázva ezután zselatinnal kevertünk 10 mg/m! 1%-os zselatin-oldat végső koncentráció eléréséig és utána 4 °C-on tároltuk. A bezárt EDTA szivárgását az idő függvényében a 14C/3H arány csökkenésével ellenőriztük. Ahogy az I. táblázatból látható, nemcsak a részecske maradt változatlan, hanem a szerkezetben lévő anyag is bezárva maradt a tárolás folyamán. /. Táblázat Zselatin stabilizáció hatása a méretre és a részecskébe kapszuláit anyagra 4 Napok száma előállítás után Méret A° 14C/3H 0 867 0,143 3 888 0,154 7 888 0,147 9 880 0,157 43 881 0,157 3. példa A részecskék tárolás utáni fizikai tulajdonságainak a további bemutatása céljából a gél-beágyazóanyagban tárolt részecskéket radioaktív 111ín-üd terheltük. Egy gamma-sugárral zavart sarkos koiacidencia-spektrométert (PÁC) használtunk a részecskék érintetlenségének a mérésére terhelés után, amelyhez Kwang K. J. and Mauk M.R., Proc. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
