200695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szöveti plazminogén aktivátort tartalmazó stabil gyógyszerkészítmények elöállítására
HU 200695 B olatot H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Mill, Storehouse, Gloucestershire, Anglia) betétet használva ukraszűréssel koncentráljuk. Ily módon koncentrált, tisztított vizes t-PA oldatot kapunk (2.S00.000 NE/ml), amely 0,1 mól/1 nátrium-citrátogn a sósav hozzáadásából származó 0,23 mó!4 nátrium-kloridot és kO.Ol vegyes% Tween 80-at tartalmaz, az oldat pH-ja 3,0. A kapott ddatot kb. 14.000 mól tömeg éeresztőképességűdializálócsőbendializáljuk,a4*C- on, négyszer 50 ml szűréssel sterilizált, 0,01 vegyest Tween 80-at tartalmazó fiziológiás sóoldattal (0,85 vegyes%-as nátrium-klorid-oldat) szemben, amelynek pH-ját tömény sósavoklattal 3,0-ra állítottuk. Minden egyes dialízis-lépést 12 órán át folytatunk. A vizes oldatot a dializáló tömlőből kivéve szűréssel sterilizáljuk, majd fiziológiás sóoldattal 500.000 NE/ml t-PA-koncentrációra hígítjuk. A kapott parenterális oldatot ezután üvegcsövekbe tétjük, leforrasztjuk, és -20 *C-on fagyasztva tárcájuk. 2. példa Transzformált CHO sejtvonal tenyészetéből — amelyet a [Molecular and Cellular Biologhy, 5(7), 1750^-1759 (1985)] irodalmi helyen leírtak szerire állítunk elő—nyert, t-PA-t tartalmazó derített oldatot kromatográfiásan tisztítunk, és a t-PA-t 0,17 mól/1 nátrium-citrátot és 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó vizes oldat formájában (pH 55) összegyűjtjük. Az oldat pH-ját sósavoldattal 3,0-ra állítjuk, és a kapott oldatot H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Anglia) betétet használva ultraszűréssel koncentráljuk. A koncentrált oldatot gélszűrő-oszlopra víve (Sephadex G-150, Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Svédország) tovább tisztögjuk, az eluálist 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó 035 vegyes%-os nátriumklorid-oldattal (pH 3,0) végezzük. A t-PA nagy tisztaságú vizes oldatát egyszeri használatra szánt művesével dializálva újra koncentráljuk. Az oldat pH-ját nátrium-hidroxid-oldattal 55-re állítva kicsijük a t- PA-t, és a szuszpenziót 2 órán keresztül 4 *C-on tartjuk. A szuszpenziót4000 g-vel 30 percen át centrifugáljuk 4 *C-on. A centrifugálással kiülepített t-PA-t 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó 035 vegyes%os vizes nátrium-klorid-ddatban újra okijuk, és {diját sósavval 3,0-ra állítjuk. A sóoldat térfogatát úgy választjuk meg, hogy a t-PA koncentrációja 7500.000 és 10.000.000NE/ml közötti legyen. A kapott t-PA-oldatot 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó 055 vegyes%-os nátrium-klorid-oldattal (pH 3,0) és a fenti savas sóoldathan 10 vegyes% mannitot tartalmazó oldattal hígítjuk oly módon, hogy a t-PA végkoncentrációja 5.000NE/ml, a mannité 25 mg/ml legyen. A legott oldatot sterilre szűrjük és 1 ml-enként csövekbe töltjük, a csöveket -20 ‘C-on fagyasztva tároljuk. 3. példa Az 1. példa szerint előállított parenterális oldat trombolitikus hatását in vivo nyaki véna trombózis modellen határozzuk meg. A vizsgálatot lényegében Collen és munkatársai [J. Clin. Invest 2L 368-376 (1983)] módszere szerire végezzük. Az lí. példa szerint előállított parenterális oldatot hagyjuk felolvadni, majd 0,01 vegyes% Tween 80-at 7 tartalmazó, pH 3,0-ra állított steril izotoniás sóoldattal hígítva a t-PA-ból 500.000 NE/ml dózist biztosító, 2 órás infúzióhoz elegendő mennyiségű oldatot állítunk elő. Az infúziót a jobboldali combvénába adjuk, kanül segítségével, a feoti vizsgálatot három újzélandi fehér nyúlon végezzük. Az infúzió beadása után kiértékeljük a trombolitikus hatást. Az 1. példa szerűit előállított parenterális oldat trombolitikus hatását az azzal elérhető 223 ± 4,2% trombolizis bizonyítja. Ezen túlmenően, semmiféle káros hatást nem tapasztaltunk a parenterális oldat infúziós adagolása sarán. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás hatóanyagként szöveti plazminogén aktivátort tartalmazó stabil, vizes, parenterális oldat előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) az ismert módon előállított szöveti plazminogén aktivátorból ismert módon készített tisztított oldat közegét pH 2-5 értékű, kívánt esetből egy vagy több ismert adalékanyagot tartalmazó vizes közegre cseréljük; vagy (b) az ismert módon előállított szöveti plazminogén aktívátort pH 2-5 értékű, kívánt esetben egy vagy több ismert adalékanyagot tartalmazó vizes közegben oldjuk; majd a kapott oldatot sterilizáljuk. (Elsőbbsége: 1985.08.31.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szöveti plazminogén aktíváimként vagy egy láncú, vagy kétláncú formában lévő szöveti plazminogén aktívátort használunk. (Elsőbbsége: 1985.08.31.) 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan szöveti plazminogén aktívátort használunk, amelynek aminosav-szekvenciája az 1. ábra szerinti, vagy attól annyiban tér el, hogy az N- terminális szerintői a245. aminosav metionin helyett valin, vagy úgy, hogy a szekvenciából az első három aminosav bármelyike is hiányzik, vagy úgy, hogy az N-terminálison egy Gly-Ala-Arg többlet-szekvenciát is tartalmaz adott esetben. (Elsőbbsége: 1985.08.31.) 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szöveti plazminogén aktívátorként rekombináns DNS-technikával nyert transzformált vagy transzfektált sejtvonal tenyésztésével előállított szöveti plazminogén aktívátort használunk. (Elsőbbsége: 1985.08.31.) 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén aktívére koncentrációját 100.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be. (Elsőbbsége: 1985.08.31.) 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén aktívéire koncentrációját 500.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be. (Elsőbbsége: 1985.08.31.) 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén aktívátre koncentrációját 1.000.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be. (Elsőbbsége: 1985.08.31.) 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén aktívére koncentráció8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
