200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 az egyik pozitív plazminogén aktivátor cDNS kiónt a 25. számú szűrőn (nyíl jelzi). A 4. ábrán az emberi szövetekben található, teljes hosszúságú plazminogén aktivátor cDNS restrikciós endonukleázokkal végzett vizsgálatának eredményét mutatjuk be. A restrikciós endonukleázokkal végzett hasítások folyán létrejött töredékek számát és méretét 6 %-os akrilamid géleken keresztül végzett elekroforézissel állapítottuk meg. A restrikciós helyek helyzetét a nukleinsav-szekvenciákkal igazoltuk (amelyek az 5. ábrán találhatók). Az ábrán a rovátkolt szakasz a valószínű jelpeptid szekvenciát, a pontozott rész pedig a szövetekben található, valószínű, érett plazminogén aktivátor szekvenciát (527 aminosav) jelenti. Az mRNS 5’ vége balra, a 3’ vége jobbra van. Az 5a., 5b. és 5c. ábra az emberi szövetekben található, teljes hosszúságú plazminogén aktivátor cDNS nukleotid szekvenciáját és az abból levezetett aminosav-szekvenciát mutatja be. Az érett szekvenciát megelőző 35 aminosavat (-35-től -1-ig) megszakítatlan szekvenciaként tüntetjük fel. Úgy véljük, hogy ez a 35 aminosavból álló szekvencia egy hidrofil „pro”-szekvenciából áll, amely megelőzi az érett fehérje szerinjét (+1), s 12-15 aminosavat tartalmaz. Ezt viszont egy hagyományos hidrofób jel (5’-től -35-ig tart) előzi meg. A kiválasztott fehérjékre vonatkozólag ezt a fajta pre-pro szerkezetet korábban már leírták, például a preproalbumin esetén. Elfogadva ezt az elméletet, a szövetekben található, kiválasztott plazminogén aktivátor molekulák mindegyike a szerinnel (+1) kezdődik, amely az amino-végcsoportot adja. Egy másik elmélet szerint a hidrofil szekvencia olyan módon lehet kapcsolatban a szövetekben található plazminogén aktivátor működésével, mint annál a plazminogénnél. ahol egy 10.000 dalton molekulasúlyú fehérje hasítható le a natív plazminogén amino-végcsoporttal ellátott részéről (Glu-plazminogén), és így egy kisebb molekula jön létre, új amino-végcsoporttal (Lys-plazminogén). A Lys-plazminogén könnyebben aktiválódik plazminná, és nagyobb az affinitása a fibrin iránt, mint a Glu-plazminogéné. A plazminról kimutatták, hogy katalizálja a Glu-plazminogénnek Lys-plazminogénné történő átalakulását. Ez a típusú szabályozó mechnizmus „pozitív viszszacsatolási” mechanizmust eredményez. A képződő plazmin első mennyiségei, amellett, hogy elbontják a fibrint, olyan plazminogén molekulák képződését eredményezik, amelyek könnyebben aktiválódnak, és szorosabban is kötődnek az alapanyagukhoz, mint a natív plazminogén. Ennek eredménye a fibrin gyorsabb bomlása. A szövetekben található plazminogén aktivátor hidrofil peptidjével kapcsolatban hasonló lehet a mechanizmus, és hasadása az enzimnek a fibrinhez történő módosított kötődését eredményezi. Mindenesetre úgy véljük, hogy a 35 aminosavból álló szekvencia az érett fehérje előszekvenciája. A 6. ábra a szövetekben található plazminogén aktivátor pARIPA0 termelő plazmidjának felépítését mutatja be vázlatosan. A pPA25E10 kiindulási plazmidot először feltártuk Pst I enzimmel, elkülönítettünk egy 376 bázispárból álló töredéket, amelyet azután az ábrán bemutatott módon tártunk fel. A 7. ábra a pARIPA0 plazmiddal transzformált sejtek segítségével előállított termék fibrinolítikus aktivitásának fibrinlemezes vizsgálatával kapott eredményt szemlélteti. A 8. ábrán a találmány szerinti, szövetekben található plazminogén aktivátor tripszines feltárásával képződő peptidek nagynyomású folyadékkromatográfiás meghatározásának eredményét tüntetjük fel (abszorbancia 210 nm-en). A nyíl azt a csúcsot jelzi, amely a telepkészlethez használt nukleotid minta tervezésére szolgáló peptidnek felel meg. A csúcsnak megfelelő peptid teljes szekvenciája: L-T-W-E-Y-C-D-V-P-S-C-S-T-C-G-L. A többi főbb csúcshoz tartozó szekvenciákat szintén meghatároztuk, és azt használtuk, hogy alátámasztják az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor helyes aminosav-szekvenciáját. A peptideknél alkalmazott egybetűs jelölés a következőképpen felel meg az aminosav-jelöléseknek: Asp D aszparaginsav Thr T treonin Ser S szerin Glu E glutaminsav Pro P prolin Gly G glicin Alá A alanin Cys C cisztein Val V valin Met M metionin Ile I izoleucin Leu L leucin Tyr Y tirozin Phe F fenilalanin His H hisztidin Lys K lizin Arg R arginin Trp W triptofán Gin Q glutamin Asn N aszparagin A 9. ábrán egy olyan plazmid kialakítását tüntetjük fel, amely az emberi szövetekben előforduló érett plazminogén aktivátor Escherichia coli törzsben történő közvetlen kifejeződését kódolja. 50 pg pPA17 plazmidot feltártunk Sau3AI, Hindii és Hhal enzimekkel, és elektroforézist végeztünk 6 %-os poliakrilamid gélen. Mintegy 0,5 pg mennyiséget nyertünk ki az 55 bázispárból álló Sau3AI-HhaI töredékből. Hasonló módon, körülbelül 3 pg mennyiségű, 263 bázispárból álló Hhal-NarI töredéket kaptunk tisztítás után 80 pg pPA25E10 klónból, amelyből először egy 300 bázispárból álló Pstl-NarI töredéket különítettünk el, majd feltártuk ezt a töredéket Hhal enzimmel. Valamennyi feltárást 37 °C hőmérsékleten végeztük 1 órán át. A reakióterméket feloldottuk és elektroelúciónak vettük alá 6 %-os poliakrilamid gél alkalmazásával. A két jelzett dezoxiolisonukleotidot: 5’ dAATTCATGTCTTÄTCAAGT (I) és 5’ GATCACTTGATAAGACATG (II) a szilárd fázisú foszforsav-triészteres módszerrel (51) szintetizáltuk. 100 pmól (II) oligonukleotidot 30 pl mennyiségű reakcióelegyben foszforileztünk, amely 60 mM triszt (pH = 8), 10 mM magnézium-kloridot, 15 mM béta-merkapto-etanolt és 50 pCi (gamma 3-P) ATP-t 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
