200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 (Amersham, 5000 Ci mmóH) tartalmazott. Hozzáadtunk 12 egység T4 polinukleotid kinázt, és hagytuk, hogy a reakció lejátszódjon 37 ”C-on 15 perc alatt. Ekkor 1 pl mennyiségű 10 mP ATP-t és 12 egység T4 kinázt adtunk hozzá, és a reagáltatást további 30 percig folytattuk. Fenollal és kloroformmal végzett extrakció után a (II) foszforilezett oligomerhez és az (I) 5’ hidroxil-oligomerhez 0,5 pg mennyiségű eluált, 55 bázispárból álló Sau3AI-HhaI töredéket, továbbá 2 pg mennyiségű, 263 bázispárból álló Hhal-Narl töredéket adtunk, és etanollal kicsaptuk. Ezeket a töredékeket 4 órán át kapcsoltuk össze szobahőmérsékleten 60 pl térfogatú reakcióelegyben, amely 20 raM trisz-hidrokloridot (pH = 7,5), 10 mM magnézium-kloridot, 10 mM ditiotreitolt, 0,5 mM ATP-t és 1000 egység T4 DNS ligázt tartalmazott. Az elegyet 1 órán át tártuk fel 48 egység NarI, 20 egység EcoRI és 40 egység BglII alkalmazásával (annak érdekében, hogy elkerüljük a kohéziós Sau3AI végződések összekapcsolódása folytán esetleg fellépő polimerizációt), majd elektroforézist végeztünk 6 %-os poliakrilamid gélen. A 338 bázispárból álló (mintegy 0,1 pg mennyiségű) terméket nyertünk ki elektroelúcióval. A t-PA kódoló szekvenciák fennmaradó részét (111— 528 számú aminosavak) egy 1645 bázispárból álló töredékből különítettük el, feltárva a pPA25E10 plazmidot NarI BglII enzimekkel. A pLeIFAtrpl03 plazmid a pLeIFA25 (52) plazmidnak egy olyan származéka, amelyből eltávolították a LelF A géntől távoleső EcoRI helyet (53). 3 pg pLeIFAtrpl03 plazmidot feltártunk 20 egység EcoRI és 20 egység BglII enzimmel 37 °C-on 90 percig, elektroforézist végeztünk 6 %-os poliakrilamid gélen, és a nagy (mintegy 4200 bázispárból álló) vektortöredéket nyertük ki elektroelúcióval. A végső kialakításhoz 80 ng EcoRI-BglII pLel- FAtrpl03 töredéket összekapcsoltunk 100 ng mennyiségű, 1645 bázispárból álló Narl-BglII töredékekkel és 20 ng mennyiségű, 338 bázispárból álló EcoRI-NarI töredékkel. Az összekapcsolást 10 órán át végeztük, szobahőmérsékleten. A kapott elegyet felhasználtuk Escherichia coli K-12 294 törzs transzformálására. A transzformánsok közül 38-ból előállítottuk a plazmid DNS-t, és feltártuk EcoRI enzimmel. A plazmidok közül tíz tartalmazta a kívánt, 600 bázispárból álló és 472 bázispárból álló EcoRI töredékeket. A DNS-szekvencia vizsgálata igazolta, hogy e plazmidok egyike (pt-PAtrpl2) rendelkezik a kívánt nukleotid szekvenciával a trp promotor, a szintetikus DNS és cDNS közötti illeszkedésnél. A 10. ábrán a találmány szerint előállított plazminogén aktivátor fibronilítikus aktivitásának fibrin lemezes vizsgálati eredménye látható. Escherichia coli W3110/pt-PAtrpl2 törzset egy éjszakán át tenyésztettünk Luria húslevesben, amely 5 pg/ml tetraciklint tartalmazott, majd a tenyészetet 1:100 arányban hígítottuk M9 táptalajjal, amely 0.2 % glukózt, 0,5 % kazaminosavakat és 5 pg/ml tetraciklint tartalmazott. A sejteket addig tenyésztettük 37 °C-on, amíg az A550 értéke 0,2 nem lett, majd indol-akrilsavat adtunk hozzá 20 pg/ml végső koncentráció eléréséig. A mintákat centrifugálással gyűjtöttük össze A550 = 0.5-0.6 értéknél (körülbelül 2 x 10x sejt/ml). és azonnal megfagyasztottuk. A sejtszemcséket 6M guanidin-hidroklorid-oldatban szuszpendáltuk 5 x 108 sejt/ml koncentrációban, 10 másodpercig ultrahanggal kezeltük, 24 °C-on 30 percig inkubáltuk, végül 4 órán át dializáltunk egy olyan oldattal szemben, amely 25 mM trisz-hidrokloridot (pH = 8,0), 250 mM nátrium-kloridot, 0,25 mM etilén-diamin-tetraecetsavat és 80,01 % Tween 80-t tartalmazott. A dialízis után a mintákat 2 percig centrifugáltuk 13000 x g értéken, és a felülúszó folyadékokból mindig 10 pl mennyiségnek vizsgáltuk meg a plazminogén aktivátor aktivitását. Granelli-Pipemo és Reich eljárása (87) szerint a lemezt 3,5 órán át inkubáltuk 37 °C-on, és megmértük az elbontási zónákat. Számszerű adatokat úgy kaptunk, hogy a kapott eredményeket tisztított, melanoma szövetben található plazminogén aktivátor oldatának különböző hígításaival nyert eredményekkel hasonlítottuk össze. l.B. A szövetekben található plazminogén aktivátor mRNS előállítása Emberi eredetű melanoma sejteket (Bowes) használtunk. A melanoma sejteket addig tenyésztettük 100 ml Earles táptalajon (Minimal Essential Media), amelyhez nátrium-hidrogén-karbonátot (0,12 % végső koncentráció eléréséig), 2 mM glutamint és 10 % hővel inaktivált magzati borjúszérumot adtunk, amíg a monomolekuláris rétegek össze nem folytak. Annak megállapítására, hogy a melanoma sejtek valóban termelnek az emberi szövetekben található plazminogén aktivátoit, az emberi eredetű melanoma sejteket összefolyásig tenyésztettük 24 bemélyedést tartalmazó mikrotitráló edényben. 0,33 pM aprotinin proetáz inhibitor jelenlétében vagy távollétében a sejteket foszfát puffert tartalmazó sóoldattal egyszer mostuk, és 0,3 ml mennyiségű, szérummentes, metioninmentes táptalajt adtunk hozzá. 75 pCi 35S-metionint adtunk hozzá, és a sejteket 3 órán át tartottuk 37 °C-on. Ezután a táptalajokat eltávolítottuk a sejtekről, és vagy a szövetekben található plazminogén aktivátorra specifikus IgG-vel immunológiai vagy kicsapásra szolgáló preimmun szérummal kezeltük őket (54). Az immunológiai úton kicsapott termékeket elektroforézisnek vetettük alá 10 %-os nátrium-dodecil-szulfát-akrilamid gélen. A nyúlós gélt rögzítettük, megszárítottuk és fluorográfiásan vizsgáltuk. l.C. Az üzenethordozó ribonukleinsav (mRNS) elkülönítése és méret szerinti frakcionálása A melanoma sejttenyészetekből az összes ribonukleinsavat lényegében Ward és munkatársai (55) módszere szerint extraháltuk. A sejteket centrifugálással szemcsékké alakítottuk, majd azokat ismét szuszpendáltuk egy olyan oldatban, amely 10 mM nátrium-kloridot, 10 mM trisz-hidrokloridot (pH = 7,5) és 1,5 mM magnézi um-kloridot tartalmazott. A sejteket NP-40 hozzáadásával elbontottuk (olyan mennyiséget használtunk belőle, hogy a végső koncentrációja 1 % legyen), és a szilárd anyagot centrifugálással szemcséztük. A felülúszó folyadék tartalmazta az összes ribonukleinsavat, amelyet tovább tisztítottunk fenollal és kloroformmal végzett többszörös extrakcióval. A vizes fázis nátrium-klorid-koncentrációját 0,2 M értékre állítottuk be, és az összes ribonukleinsavat kicsaptuk két térfogat etanol hozzáadásával. Oligo-dT cellulóz kromatográfia segítségével tisztítottuk meg az mRNS-t 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
