200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 (1980), és 0036776 sz. publikált európai szabadalmi bejelentés]. Jóllehet ezeket használják a leggyakrabban, azonban más mikrobiológiai promotorokat is felfedeztek és alkalmaztak. A nukleotid szekvenciákkal kapcsolatos részleteket publikálták, így a szakember összekapcsolhatja őket funkcionálisan a plazmid vektorokkal [Siebenlist és munkatársai, Cell, 20, 269 (1980)]. A prokariotikus organizmusok mellett eukariotikus mikrobákat, például élesztőgomba-tenyészeteket is alkalmazhatunk. Az eukariotikus mikroorganizmusok közül a leggyakrabban használt a Saccharomyces cerevisiae vagy más néven közönséges pékélesztő, jóllehet több más törzs is hozzáférhető. A Saccharomycesben történő termeléshez általánosan használt például az YRp7 plazmid [Stinchcomb és munkatársai, Nature, 282, 39 (1979), Kingsman és munkatársai, Gene, 7, 141 (1979), Tschemper és munkatársai, Gene, 10, 157 (1980)]. Ez a plazmid már tartalmazza a trpl gént, amely kiválasztási jelzőt biztosít egy mutáns élesztőgombatörzs számára, amelyből hiányzik az a képesség, hogy triptofánon növekedjen. Ilyen például az ATCC 44076 vagy PEP4-1 [Jones, Genetics, 85, 12 (1977)]. A trpl károsodásának, mint az élesztőgomba gazdasejt genóm jellemzőjének a jelenléte ekkor hatékony környezetet biztosít a transzformáció kimutatásához a triptofán távollétében történő növekedésen keresztül. Az élesztőgomba vektorokban alkalmas promotor szekvenciák a következők: promotorok 3-foszfoglicerát-kináz számára [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 12073 (1980)] vagy más glikolítikus enzimek számára [Hess és munkatársai, J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 (1968); Holland és munkatársai, Biochemistry, 17, 4900 (1978)], mint amilyen az enoláz, glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glukóz-6-foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvát-kináz, trioszfoszfát-izomeráz, foszfoglukóz-izomeráz és glukokináz. Az alkalmas kifejező plazmidok felépítésénél az ezekkel a génekkel kapcsolatos lezáró szekvenciákat szintén hozzákapcsoljuk a kifejező vektorhoz, 3’ irányba a kifejezni kívánt szekvenciától, s ezáltal elérjük az mRNS poliadenilezését és a lánclezárást. Más promotorok - amelyek további előnye a növekedési feltételek által szabályozott átírás - a következők: az alkoholdehidrogenáz 2-re. az izocitokróm C-re, a savas foszfatázra, a nitrogénanyagcserével kapcsolatos elbontó enzimekre, a fentebb említett glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázra. valamint a maltóz és a galaktóz hasznosításáért felelős enzimekre vonatkozó promotor tartományok [Holland és munkatársai idézett közleménye]. Minden olyan plazmid vektor megfelelő, amely az élesztőgombával összeférhető promotort, reprodukció-eredetet és lezáró szekvenciákat tartalmaz. A mikroorganizmusokon túlmenően többsejtű szervezetektől származó sejtek tenyészetei is használhatók gazdasejtként. Elvben minden ilyenfajta sejttenyészet működőképes, akár gerinces, akár gerinctelen élőlénytől származik. A gerincesektől származó sejteknek a jelentősége nagyobb, és az utóbbi években rutinszerű eljárássá vált a gerincesektől származó sejtek tenyésztése (szövettenyészet) [Tissue Culture, Academic Press. Kruse és Patterson szerkesztésében, 1973]. Előnyös gazdasejtvonalak például a következők: VERŐ és He- La sejtek, kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtvonalak, valamint W138, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonalak. Az ezekhez a sejtekhez használható termelő vektorok rendszerint a következőket tartalmazzák (ha szükséges): reprodukcióeredet, a termelni kívánt gén előtt elhelyezkedő promotor az esetleg szükséges riboszóma kötési helyekkel együtt, RNS-illesztési helyek, poliadenilezési hely és átíráslezáró szekvenciák. Az emlősöktől származó sejtekben történő felhasználáshoz a kifejező vektorokra irányuló szabályozó funkciókat gyakran vírus-eredetű anyag látja el. Például a polioma, Adenovirus 2 és leggyakrabban a Simian Vírus 40 (SV40) eredetű promotorok használatosak. Az SV40 vírus korai és késői promotorai különösen hasznosak, mivel mindkét promotor könnyen előállítható a vírusból olyan töredék alakjában, amely az SV40 vírusos reprodukcióeredetet is tartalmazza. [Fiers és munkatársai, Nature, 273, 113 (1978)]. Kisebb vagy nagyobb SV40 töredékek szintén használhatók, feltéve, hogy magukba foglalják azt a mintegy 250 bázispárból álló szekvenciát, amely a Hind III helytől a vírusos reprodukcióeredetben elhelyezkedő Bgl I hely felé teljed. Továbbá, az is lehetséges - s gyakran kívánatos is hogy olyan promotor vagy szabályozó szekvenciákat alkalmazunk, amelyek általában kapcsolatban vannak a kívánt génszekvenciával, feltéve, hogy az ilyen szabályozó szekvenciák összeférhetők a gazdasejt rendszerekkel. A reprodukcióeredetet vagy úgy alakíthatjuk ki, hogy exogén eredetet, például SV40-től vagy más vírustól (például polioma, Adeno, VSV, BPV stb.) származó eredetet tartalmazó vektort építünk fel, vagy a gazdasejt kromoszómáinak reprodukciós mechanizmusa gondoskodik róla. Ha a vektort beépítjük a gazdasejt kromoszómájába, az utóbbi mechanizmus gyakran elegendő. Ahhoz, hogy egy előnyös gazdasejtet válasszunk ki a találmány szerinti vektorokkal történő áífertőzéshez. amely vektorok a t-PA-t és a DHFR fehérjét kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazzák, figyelembe kell vennünk a DHFR fehérje típusát. Abban az esetben, ha vad típusú DHFR fehérjét alkalmazunk, előnyös olyan gazdasejt kiválasztása, amelynek DHFR-hiánya van, és ennek folytán lehetővé teszi a DHFR-kódoló szekvenciának mint jelzőnek az alkalmazását az eredményes átfertőzéshez olyan szelektív táptalajon, amelyből hiányzik a hipoxantin, a glicin és a timidin. Ebben az esetben a megfelelő gazdasejt a kínai hörcsög ovárium (CHO)sejtvonal, amelynek nem elegendő a DHFR aktivitása. Előállítását és tenyésztését Urlaub és Chasin ismerteti. [Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 77, 4216 (1980)]. Másrészt, ha szabályozó szekvenciaként az MTX iránt csekély kötésaffinitással rendelkező DHFR fehérjét használunk, akkor nincs szükség DHFR-hiányos sejtekre. Mivel a mutáns DHFR rezisztens a metotrexáttal szemben, az MTX-tartalmú táptalajok felhasználhatók, feltéve, hogv maguk a gazdasejtek érzékenyek a metotrexátra. Úgy tűnik, hogy a legtöbb eukariotikus sejt, amely képes az MTX felvételére, érzékeny a metotrexáttal szemben. Az egyik ilyen előnyös sejtvonal eay CHO-KI (ATCC száma CCL 61). A leírásban ismertetett példákban gazdasejtként Escherichia coli és a lac és trp promotor rendszer. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
