200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
I HU 200615 B 2 továbbá CHO sejtek, kifejező vektorokként pedig olyan vektorok alkalmazása szerepel, amelyek az SV40 reprodukcióeredetet tartalmazzák mint prompton. A találmányhoz tartozik azonban az is, ha hasonló módszerekkel más prokariotikus vagy eukariotikus gazdasejt tenyészetekben történő fehérjeszekvencia-kifejezésre alkalmas kifejező vektorokat hozunk létre. A sejttenyészetek kielégítő mennyiségben termelnek humán t-PA-t, azonban egy másodlagos kódoló szekvencia alkalmazásával még tovább növelhetjük a termelt mennyiséget. A másodlagos kódoló szekvencia dihidrofolát-reduktázt (DHFR) tartalmaz, amelyet kívülről szabályozott paraméter, például metotrexát befolyásol, és így a metotrexát (MTX) koncentrációjával szabályozható a termelés. Az alkalmazott módszereket az alábbiakban ismertetjük. Ha terjedelmes sejtmembrángátak nélküli sejteket használunk gazdasejtként, az átfertőzést a kalciumfoszfátos kicsapási módszerrel végezzük, amint azt Graham és Van der Eb leírta [Virology, 52, 456 (1973)]. Más módszerekkel is bevihetjük azonban a DNS-t a sejtekbe, például magbefecskendezéssel vagy protoplasztfúzióval. Ha prokariotikus sejteket vagy jelentős sejtfalszerkezetet tartalmazó sejteket használunk, az átfertőzést előnyösen kalcium-klorid alkalmazásával való kezeléssel végezzük, amint azt Cohen és munkatársai leírták [Proc.'Natl. Acad. Sei., (USA). 69, 2110 (1972)]. A kívánt kódoló és szabályozó szekvenciákat tartalmazó alkalmas vektorokat a szokásos összekapcsoló módszerekkel építjük fel. Az elkülönített plazmidokat vagy DNS-töredékeket elhasítjuk, átalakítjuk és a kívánt alakban ismét összekapcsoljuk, hogy kialakítsuk a szükséges plazmidokat. Az elhasítást úgy végezzük, hogy restrikciós enzimmel (vagy enzimekkel) kezeljük alkalmas puffer jelenlétében. Általában 1 jig plazmid- vagy DNS-töredékhez körülbelül 1 egység enzimet használunk mintegy 20 pl pufferoldatban. (A gyártó cégek megadják az alkalmas pufferoldatokat és a mennyiségeket az egyes restrikciós enzimekhez.) Az inkubálás ideje többnyire 1 óra 37 °C-on. Az inkubálás után a fehérjét fenollal és kloroformmal végzett extrakcióval távolítjuk el, a nukleinsavat pedig etanolos kicsapással nyerjük ki a vizes frakcióból. Ha tompa végekre van szükség, 15 percig tartó kezelést végzünk 15 °C-on 10 egység Klenow polimeráz I enzimmel, majd a terméket fenollal és kloroformmal extraháljuk, végül etanollal kicsapjuk. Az elhasított töredékek méretek szerinti szétválasztását 6 %-os poliakrilamid gél alkalmazásával végezzük, a Goeddel és munkatársai által lein módon [Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980)]. Az összekapcsolást úgy végezzük, hogy a megfelelő illeszkedéshez alkalmas módon kialakított végű komponensek közelítőleg ekvimoláris mennyiségét T4 DNS ligázzal kezeljük. 0,5 pg DNS-hez körülbelül 10 egység T4 DNS ligázt használunk. (Abban az esetben, ha komponensekként elhasított vektorokat alkalmazunk, azok újbóli összekapcsolódását bakteriális eredetű lúgos foszfatázzal végzett előkezeléssel akadályozhatjuk meg.) Ahhoz, hogy meggyőződjünk arról, hogy a megfelelő szekvenciák vannak jelen a létrehozott plazmidokban, az összekapcsolt keverékeket felhasználjuk Eschrichia coli K-12 294 törzs (ATCC 31446) transzformálására, és a megfelelő transzformánsokat az ampicillinnel vagy tetraciklinnel szemben mutatott rezisztencia alapján válogatjuk ki. A transzformánsokból kinyerjük a plazmidokat, restrikciós analízist végzünk és/vagy meghatározzuk a szekvenciákat Messing és munkatársai [Nucleic Acids. Res., 9, 309 (1981)] vagy Maxam és munkatársai [Methods in Enzymology, 65 499 (1980)] módszerével. Á DHFR fehérjét kódoló szekvenciákat oly módon növeljük meg, hogy a gazdasejt-tenyészeteket 20- 500.000 nM metotrexát jelenlétében tenyésztjük, ahol a metotrexát a DHFR aktivitás kompetitiv inhibitora. A hatékony koncentráció tartomány természetesen erősen függ a DHFR gén és fehérje természetétől, valamint a gazdasejt jellemzőitől. Más folsav analógok vagy egyéb, a DHFR-t gátló vegyületek is használhatók alkalmas koncentrációkban. Maga a metotrexát azonban megfelelő, könnyen hozzáférhető és hatékony. Az alábbiakban a találmány előnyös változatait ismertetjük. Az emberi szövetekben található plazminogén aktivátort a következő műveletekkel állítottuk elő: 1. Emberi melanoma sejteket - amelyek aktívan termelnek plazminogén aktivátort - összefolyásig tenyésztettünk. 2. A sejttenyészetből kinyert sejtüledéket ribonukleáz inhibitorok jelenlétében extraháltuk, és ilyen módon elkülönítettük az összes citoplazma ribonukleinsavat. 3. Egy oligo-dT oszlopon elkülönítettük az összes üzenethordozó rimbonukleinsavat (mRNS) poliadenilezett alakban. Ezt az mRNS-t gél elektroforézissel frakcionáltuk méret szerint (savas, karbamidos agaróz gél alkalmazásával). 4. A plazminogén aktivátorra specifikus RNS-t tartalmazó gélfrakciót a következőképpen azonosítottuk: Minden egyes gélfrakcióból a ribonukleinsavat kutyapankreász mikroszómákkal kiegészített, in vitro elbontott nyúl retikulocita rendszerbe fordítottuk le. A kapott lefordítási termékeket kicsaptuk immunológiai úton, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátorra specifikus IgG antitesttel. 5. A megfelelő (21. és 24S. közötti) RNS-t egyágú kiegészítő dezoxiribonukleinsavvá (cDNS) alakítottuk, amelyből cDNS kettős spirált állítottunk elő. Poly-dC kezelés után az átalakított anyagot vektorba, például egy vagy több fenotípusjelzőt hordozó plazmádba illesztettük. 6. Az ily módon nyert vektorokat felhasználtuk bakteriális eredetű sejtek transzformálására, és ezáltal klónozott cDNS készletet hoztunk létre. A t-PA ismert aminosav-szekvenciáinak kodonjait kiegészítő, rádióaktív izotóppal jelzett szintetikus dezoxi-oligonukleotidok keverékét készítettük el. és felhasználtuk a telepkészlet vizsgálatához. Például nyolc 14-mer 5’-dTC(Q)CA( q)TA( £)TCCCA-3’ elegyét állítottuk elő, ezek kiegészítették azokat a szekvenciákat, amelyek az isméit triptofán - gluta-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
