200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 teknek kell termelniük, amelyek képesek a túlélésre hipoxatinban, glicinben és timidinben hiányos táptalajon (-HGT táptalaj). Általában azok a sejtek, amelyekből hiányzik a DHFR fehérje, nem képesek növekedésre ezen a táptalajon. Azok a sejtek viszont, amelyek tartalmazzák a DHFR fehérjét, eredményesen növekednek ezen a táptalajon. Az „MTX-re érzékeny sejtek” kifejezés olyan sejtekre vonatkozik, amelyek nem képesek növekedésre a DHFR-gátló metotrexátot (MTX) tartalmazó táptalajokon. Az MTX-re érzékeny sejtek tehát olyan sejtek, amelyek genetikai megváltoztatás vagy egyéb kiegészítés nélkül nem növekednek olyan körülmények között, amelyek egyébként megfelelnek a sejttípusnak, ha az MTX-koncentráció 0,2 pg/ml vagy ennél több. Egyes sejtek, például a baktériumok nem mutatnak MTX iránti érzékenységet, mivel nem engedik be a metotrexátot a sejtfalon belülre, jóllehet tartalmaznak DHFR-t, amely egyébként érzékeny erre az anyagra. Általában azok a sejtek, amelyek a DHFR fehérjéjükként vad típusú DHFR-t tartalmaznak, érzékenyek a metotrexátra, ha átengedik azt vagy képesek a felvételére. A „vad típusú DHFR” kifejezés olyan dihidrofolát-reduktázra vonatkozik, amely általában a szóbanforgó organizmusban található. A vad típusú DHFR általában in vitro érzékeny a kis koncentrációban jelenlévő' metotrexátra. Az „MTX iránti csekély kötésaffmitású DHFR fehérje” kifejezésnek funkcionális definíciója van. Ez olyan DHFR fehérje, amely - ha a sejteken belül képződik - lehetővé teszi az MTX-re érzékeny sejtek növekedését olyan táptalajon, amely 0,2 pg/ml vagy ennél több metotrexátot tartalmaz. Tisztában vagyunk azzal, hogy az ilyen, funkcionális szempontból megfogalmazott definíció függ attól, hogy az organizmus mennyire könnyen termeli az MTX iránti csekély kötésaffmitású DHFR fehérjét, és függ magától a fehérjétől. E definíciónak a találmánnyal kapcsolatos használata során azonban e két mechanizmus hatása nem jelent problémát. A találmány szerint olyan képességet biztosítunk az anyagnak, hogy elviselje ezeket a metotrexát-koncentrációkat, és nincs annak jelentősége, hogy a képződő DHFR mellett még a megnövekedett termelés is befolyásolja ezt. A fenti definíciónak megfelelő DHFR fehérjét a 459,151 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ismerteti, amely 1983 január 19-én lett benyújtva. A „kifejező vektor” kifejezésen olyan vektorokat énünk, amelyek képesek a találmány szerinti DNS- szekvenciák kifejezésére, s ezek a szekvenciák működőképes módon kapcsolódnak más, a termelésükre képes szekvenciákhoz. Jóllehet nem mindig hangsúlyozzuk, azonban a fenti kifejezés azt is tartalmazza, hogy a kifejező vektoroknak reprodukcióra képesnek kell lenniük a gazdasejtben, vagy mint episzómák, vagy pedig mint a kromoszóma DNS szerves részei. Nyilvánvaló, hogy a reprodukció hiánya ténylegesen működésképtelenné tenné a kifejező vektorokat. Öszszefoglalva, a kifejező vektor definíciója funkcionális, és minden olyan DNS-szekvenciát magába foglal, amely képes egy megadott, találmány szerinti DNS- kód termelésének biztosítására. Általában a DNS-rekombinációs módszereknél használt kifejező vektorok gyakran plazmidok alakjában vannak jelen. Ezek DNS kettős spirálokra vonatkoznak, amelyek a vektor alakjukban nem kötődnek kromoszómához. A leírásban a „plazmid” és a „vektor” kifejezést egymással felcserélhetően használjuk, mivel a plazmid a vektor legközönségesebben használt alakja. A találmány azonban a kifejező vektorok más olyan formáira is kiterjed, amelyek a fentiekkel egyenértékű feladatokat látnak el, és amelyek később válnak ismertté a szakemberek körében. „Rekombinált gazdasejtek” kifejezésen olyan sejteket értünk, amelyeket DNS-rekombinációs módszerekkel létrehozott vektorokkal transzformáltunk. A találmány szerint a t-PA termelése a transzformálás következtében jelentős mennyiségben történik, és nem olyan csekély vagy többnyire nem is kimutatható mennyiségben, ahogy a transzformálatlan gazdasejt termeli. A transzformált gazdasejtek által termelt t-PA-t rekombinációs t-PA-nak is nevezhetjük. A gazdasejtek tenyészetei és a vektorok A leírásban ismertetett vektorok és módszerek sokféle prokariotikus és eukariotikus organizmus közül kiválasztott gazdasejtekben használhatók. Általában a prokariotikus organizmusokat részesítjük előnyben a DNS-szekvenciák klónozásához, amikor a találmány szerinti eljáráshoz felhasználható vektorokat kívánjuk létrehozni. Különösen előnyös például az Escherichia coli K-12 294 törzs (ATCC 31446). További előnyös mikrobiológiai törzsek a következők: Escherichia coli B és Escherichia coli XI776 (ATCC 31537). Természetesen a találmány nem korlátozódik ezeknek a törzseknek az alkalmazására. A kifejeződéshez is felhasználhatók a prokariotikus organizmusok. Használhatók például a fenti törzsek, valamint a következők: Escherichia coli W3110 (F~, X~, prototróf, ATCC 27325), bacillusok, mint Bacillus subtilis és más enterobacteriaceae, így Salmonella typhimurium vagy Serratia marcescens és különböző preudomonas fajták. Ezekhez a gazdasejtekhez általában olyan plazmid vektorokat használunk, amelyek replikont és a gazdasejttel összeférhető anyagoktól származó szabályozó szekvenciákat tartalmaznak. A vektorban rendszerint megtalálható egy reprodukció hely, valamint olyan jelző szekvenciák vannak benne jelen, amelyek képesek a fenotípus kiválasztására a transzformált sejtekben. Például az Escherichia coli törzseket rendszerint a pBR322 plazmiddal transzformáljuk, amely Escherichia coli törzsektől ered [Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 95 (1977)]. A pBR322 plazmid az ampicillinnel és a tetraciklinnel szembeni rezisztenciára vonatkozó géneket tartalmaz, és ennek következtében könnyen felhasználható a transzformált sejtek azonosítására. A pBR322 vagy más mikrobiológiai eredetű plazmidnak promotorokat is tartalmaznia kell, vagy megfelelő módosítást igényel, hogy tartalmazzon promotorokat. Ezeket a mikroorganizmus a saját fehérjéinek a termeléséhez használhatja fel. A DNS-rekombinációhoz leggyakrabban használt promotorok a béta-laktamáz (penicillináz) és laktóz promotor rendszerek [Chang és munkatársai, Nature, 275, 617 (1978) ; Itakura és munkatársai, science, 198, 1056 (1977); Goeddel és munkatársai. Nature, 281, 544 (1979) ], valamint egy triptofán (trp) promotor rendszer [Goeddel és munkatársai. Nucleic Acids Res., 8, 4057 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
