200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 A 6. ábrán a pARIPA0 kifejező plazmid kialakításának vázlata látható. A 7. ábra azokat az eredményeket nutatja be, amelyeket a pARIPA0 plazmiddal transzformált Escherichia coli sejtek fibrinolítikus aktivitásának fibrinlemezes vizsgálatakor kaptunk. A 8. ábrán a humán t-PA tripszinnel végzett feltárásakor képződött peptidek HPLC vizsgálatának eredményei láthatók. A 9. ábra az érett humán t-PA Escherichia coli törzsben történő közvetlen kifejezését kódoló plazmid kialakítását mutatja be. A 10. ábra pt-PAtrpl2 plazmiddal transzformált Escherichia coli törzsben termelt humán t-PA fibronilítikus vizsgálatának eredményeit mutatja. A fibronilítikus aktivitást fibrin lemezzel vizsgáltuk. A 11. ábra mutáns vagy vad típusú DHFR/t-PA kialakítását mutatja be. Ez olyan plazmidokat kódol, amelyekkel emlősöktől származó szövetek sejttenyészetei transzformálhatok. A 12. ábrán a találmány szerint előállított, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor vázlatos rajza látható. Az alábbiakban foglalkozunk a leírásban használt kifejezésekkel. Az „emberi szövetekben található plazminogén aktivátor” vagy „humán t-PA” vagy „t-PA” olyan humán exogén (szövettípusú) plazminogén aktivátor, amelyet mikrobiológiai vagy sejttenyészet rendszerek termelnek, biológiailag aktív alakban tartalmaz egy proteáz részt, és megfelel az emberi szövetek szempontjából egyébként natív plazminogén aktivátoroknak. A találmány szerint előállított, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor fehérjét meghatározott DNS-gén segítségével és az aminosav-szekvenciák megállapításával definiáltuk. Magától értetődik, hogy léteznek természetes alléi változatok. Ezek a változatok úgy mutathatók ki, hogy az egész szekvenciában egy vagy több aminosavban eltérés található, vagy egy vagy több aminosavat érintő törlés, helyettesítés, beillesztés, inverzió vagy kiegészítés fordul elő a szekvenciában. Emellett a glikozileződés helye és mértéke függ a gazdasejt tulajdonságától. A DNS-rekombinációs technológia alkalmazásakor fennáll annak a lehetősége, hogy olyan különféle, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor származékokat kapunk, amelyek eltérő módon módosítottak egy vagy több aminosavat érintő helyettesítések, törlések, kiegészítések folytán. A találmány körébe tartozik az olyan származékok előállítása is, amelyek megtartják a lényegesen kringle horog tartományt és a szerin proteáz tartományt, egyébként azonban a fentiek szerint módosítottak. (Az említett két tartomány általánosságban jellemző az emberi szövetekben található plazminogén aktivátorra.) Mindezek az alléi változatok és módosulatok a találmány körébe tartoznak, akárcsak más. hasonló humán exogén (szövettípusú) plazminogén aktivátorok. amelyek fizikai és biológiai szempontból hasonlóak. Ezeket az anyagokat mindaddig plazminogén aktivátoroknak tekintjük, amíg az emberi szövetekben található jellemző plazminogén aktivátor aktivitás típusa változatlan marad. A találmány szerint olyan, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátort állítunk elő. amely 1. első aminosavként metionint tartalmaz (annak következtében, hogy az ATG beindító jel kódon a szerkezeti gén elé lett beillesztve), vagy 2. ha a metionin a sejten belül vagy a sejten kívül lehasadt, a normálisan első aminosavját tartalmazza, vagy 3. ha a szokásos jel polipeptidtől eltérő konjugált fehérjét vagy a jel polipeptidet tartalmaz, azok specifikus módon lehasíthatók a sejten belül vagy a sejten kívül (lásd a 21. hivatkozást), vagy 4. érett alakban képződik közvetlen kifejezéssel, és így nincs szükség külső, felesleges polipeptid lehasítására. Ez utóbbi különösen akkor fontos, ha az adott gazda nem képes a jel peptid eltávolítására vagy hatékony eltávolítására, amikor a kifejező hordozó olyan felépítésű, hogy a jelpeptidjével együtt fejezi ki a plazminogén aktivátort. Minden esetben a találmány szerint előállított humán t-PA-t a különböző alakjaiban kinyerjük és addig tisztítjuk, hogy felhasználható legyen a keringési megbetegedések kezeléséhez. Továbbá, a t-PA-nak léteznek olyan formái, amelyek az egyláncú fehérjét és a kétláncú fehérjét tartalmazzák. Ez utóbbi proteolítikus úton képződik az egyláncú vegyületből. Feltehetőleg a kétláncú fehérje a termelt fibrinnel van kapcsolatban, és az egyláncú anyag proteolítikus átalakulása a kétláncú anyaggá azon a helyen játszódik le, ahol a plazminogén plazminná alakul. A találmány szerint az egyláncú fehérjét adjuk be a leírt in vivo átalakuláshoz, azonban a kétláncú fehérjét is beadhatjuk a kezelt személynek, mivel ez az anyag is aktív. A kétláncú fehérjét in vitro állíthatjuk elő proteolítikus úton, az egyláncú anyag előállítása után. Egy úgynevezett „kringle” horog rész helyezkedik el a szerin proteáz rész után, és úgy véljük, hogy ez fontos szerepet játszik abban, hogy a találmány szerinti, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor fibrinvázhoz kötődjön. Ennek a következménye a találmány szerinti plazminogén aktivátor megfigyelt specifikus aktivitása a megfogható, jelenlévő trombusok iránt. A találmány szerint olyan plazminogén aktivátort állítunk elő, amely tartalmazza a natív anyagnak megfelelő, aktív enzimrészt. így az „emberi szövetekben található plazminogén aktivátor” kifejezés olyan termékeket definiál, amelyek ezt az enzimrészt önmagában vagy további aminosav-szekvenciákkal együtt tartalmazzák, ahol a fenti enzimrész és a további aminosav-szekvenciák határesetben a teljes hosszúságú molekulát képezhetik. A leírásban tehát a humán t-PA definíciója funkcionális: képes a plazminogén plazminná való átalakulásának katalizálására, a fibrinhez kötődik, és a fentebb ismertetett immunológiai tulajdonságok alapján t-PA-nak minősül. Amikor a „gyakorlatilag tiszta alakban” kifejezést használjuk a találmány szerint előállított humán t-PA állapotának leírására, ezen azt értjük, hogy a termék mentes azoktól a fehérjéktől vagy egyéb anyagoktól, amelyek a nem-rekombinált sejtek által, azaz a ..natív" környezetben termelt humán t-PA-t általában kísérik. A „DHFR fehérje" kifejezés olyan fehérjére vonatkozik. amely képes a dihidrofolát-reduktázzal (DHFR) kapcsolatos aktivitásra, és amelyet ezért olyan sej5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
