200506. lajstromszámú szabadalom • Reagens, glükóz biológiai mintákban való meghatározásához
1 HU 200 506 A 2 A találmány tárgya új reagens glükóz biológiai mintákban történő meghatározására, amely 4-amino-fenazont enzim-katalizátort, puffer-oldatot, konzerválószert, valamint egy új színreaktánst tartalmaz. Ismert, hogy a klinikai kémiában egyre nagyobb jelentőségű a biológiai mintákból, előnyösen emberi vérből, ill. vizeletből történő glükóz gyors, pontos mennyiségi meghatározása. Az ismert módszerek azon alapulnak, hogy minták glükóz-tartalmát glükózoxidáz (GOD) katalízissel oxidálják, a keletkezett hidrogén-peroxidot peroxidáz (POD) katalízissel bontják. Az így létrejött atomos oxigén a reakciókeverékben lévő 4-amino-fenazonnal más - valamely fenolt vagy fenol-származékot tartalmazó - színreaktánssal a minta glükóz-koncentráció- 15 jával arányos színintenzitású terméket hoz létre, melyet fotometriásan egyszerűen mérhetünk. A 4-amino-fenazon (kémiai nevén: l-fenazol-2,3- dimetil-3-amino-pirazolin-5-on) fenollal való reakcióját P. Trinder alkalmazta először a vér glükóz-tartal- 20 mának meghatározására. (Ann. Clin. Biochem. 6, 24 [1969].) Ezt követően az irodalom meglehetősen nagyszámú változatot ismertet a fenol különböző vegyületekkel, elsősorban fenol-származékokkal, hidroxibenzoesav-származékokkal, anilin-származékokkal és szulfonsav-származékokkal való helyettesítéséről. Ezen módszerek általános hátránya az, hogy a keletkezett szín nem kellően stabil, a mérési határok meglehetősen szűkek vagy a mérési karakterisztika nem mindig lineáris. A legújabb publikációk közül kiemelendő a 188 953 sz. magyar szabadalmi leírás. A leírás szerint reaktánsként timolt használtak. A módszer hátránya elsősorban az, hogy timolt meglehetősen nagy mennyiségű etanolban keU feloldani. A találmány célja tehát olyan reagens kidolgozása, melynek használata egyszerű, gyors, de ugyanakkor kevés és kis koncentrációjú reaktánsokat igényel, lehetőleg oldószermentes, azaz vizes közegben. Előkísérleteink során igen nagyszámú fenol-szár- 40 mazékot próbáltunk ki színreaktánsként. Különösen a 2-, 3- és 4-helyen szubsztituált fenol-származékok körét vizsgáltuk át részletesen. Kísérleteinkből megállapítottuk, hogy kiemelkedően kedvező hatás kapható m-krezol használata esetében. Ez a felismerés egyáltalán nem volt előre várható. Bár a korábbi publikációk a sokféle fenol-származékok között a kromofor-csoport kialakíthatósága szem- 5 pontjából - felsorolásszerűen - említést tesznek a krezolról is (lásd például 4 226 713 sz. szabadalmi leírás 7. hasáb), azonban semmiféle értékelhető számszerű adatot nem tartalmaznak. Az 54 358 sz. európai szabadalmi bejelentés például 10 több mint 100 vegyületet sorol fel szóba jöhető kromof or-csopor tot hordozó reagensként (ezek közül 15 vegyületről pH=5;6;6,75; valamint 8-értéken mért színreakció-időtartamot is), azonban semmi jelzés nem található az m-krezol kiváló hatásáról. Összehasonlító kísérleteinkben majdnem nagyságrendileg kedvezőbb eredményeket kaptunk, ha reaktánsként m-krezolt használtunk o-krezollal, p-krezollal vagy timollal, fenollal, 2,5-dimetü-fenollal, 5-i-propil- 2-metil-fenollal, 3,5-dimetü-fenollal összehasonlítva. Úgy tűnik, hogy a fentiek közül az aromás gyűrű elektron-eloszlása az m-krezol esetében a legkedvezőbb, a kialakult kinoidális gyűrű pedig az igen tartós színhatás elérésében játszik szerepet. A találmány: reagens biológiai mintákban történő 25 glükóz meghatározására, amely 4-amino-fenazont, enzim-katalizátort, konzerválószert, puffer-oldatot és reaktánsként 0,5-1,5 mmól/liter koncentrációban vízben oldott m-krezolt tartalmaz. A reagens egy előnyös kiviteli alakjában 0,5- 30 1,5 mmól/liter 4-amino-fenazont, 10-15 mmól/liter nátrium-azidot, 8-12 U/ml glükóz-oxidázt, 10- 20 U/ml peroxidázt (ahol U jelentése 1 nemzetközi egység), 0,05-0,5 mmól/liter Na2HP04-KH2P04-tartalmú (pH-=7,0-8,0 közötti értéket biztosító) puffer - 35 oldatot és 0,5-1,5 mmól/liter m-krezolt tartalmaz. A találmány szerinti reagens kitűnően alkalmazható diagnosztikai készlet formájában. A diagnosztikai készletet, ill. a vele végzett vizsgálat vázlatos menetét példáinkban ismertetjük. A találmány szerinti raegens optimális m-krezol koncentrációjának megválasztását az 1. táblázatban mutatjuk be. A 4-amino-fenazon-koncentráció optimalizálását a 2. táblázat adataiból láthatjuk. 1.táblázat Az optimális m-krezol koncentráció kiválasztása m-krezol koncentráció a reagens elegyben mmól/l glükóz oldat koncentráció 0,3 0,4 0,5 0,7 1,0 12 1,5 2 S mmól/l abszorbancia 0,190 0,200 0,210 0,210 0,210 0,211 0210 0210 30 mmól/l abszorbancia 1,105 1,164 1,246 1245 1,245 1,245 1245 1245 2. táblázat A 4 amino-fenazon optimális koncentrációnak kiválasztása 4-amino-fenazon mmól/l glükóz oldat koncentráció 02 0,4 0,5 0,8 1,0 12 1,5 5 mmól/l abszorbancia 0,200 0,210 0.210 0210 0210 0210 0210 30 mmól/l abszorbancia 0,870 1,080 1240 1,244 1,240 1244 1240 2
