200506. lajstromszámú szabadalom • Reagens, glükóz biológiai mintákban való meghatározásához
1 HU 200 506 A 2 A méréseket normál és pathológiás tartományban levő glükóz-oldattal és a reagenselegyben lévő 1,2 mmól/l-es koncentrációjú m-krezollal végeztük. A táblázat adatai jól tükrözik, hogy a 0,5 mmól/l-es 4-amino-fenazon koncentrációi maximális és tovább 5 nem változó abszorbanciát adtak, de biztonsági okokból az 1 mmól/l-es tekinthető optimálisnak. Linearitás-vizsgálat: 2,5; 5,0; 10; 15; 20; 25; 30; 35 mmól/1 koncentrációjú vizes glükóz standard-oldatokat használtunk, minden koncentrációból 5-5 mérést végeztünk (lásd 3. táblázat). Az adatokból látható, hogy a mérési karakterisztika - az adott tartományban (3Ö mmól/l-ig) - lineáris. A karakterisztikákat az 1. ábrán mutatjuk be. 3. táblázat Linearitásvizsgálat Glükózkoncentráció (mmől/1) 2,5 5,0 10,0 20 25 30 35 X 0,118 0,201 0,400 0,795 1,01 1,195 1,345 X 0,120 0,200 0,400 : 0,800 1,00 1,200 1,400 d%-1,6 +0,5 0,0 0,0 +0,1-0,17-4,28 X ; a mért abszorbancia átlagai X : a kalibrációs egyenes egyenletéből számitott abszorbanciák d% : a mért és a számított abszorbanciák %-os különbsége %) (100% a számított) A regressziós egyenes egyenlete: 7-0,0387 x+0,0180 Korrelációs együttható: r - 0,9994 Összefoglalva a találmány szerinti reagens előnyeit 25 megállapíthatjuk, hogy a) az m-krezol reaktáns alkalmazásával kapott színes termék abszorpciós maximuma 480-520 nm hullámhossz között van, itt jól végezhetők a fotometriás, ill. spektrofotometriás mérések, 30 b) a találmány szerinti reagens által létrehozott színreakció pH-optimuma 7,0-8,0 közötti érték és ez előnyös, mivel pH-7,8 körül a legkedvezőbb az alfa- D-glükóz mutarotációja béta-helyzetűvé, c) a korábban ismert reagenseknél (például a 188 953 35 sz. magyar szabadalmi leírás) a fehérjementesítést legfeljebb 3 tömeg%-os triklórecetsavas oldattal lehet végezni (fehérjementesítésre a mintákban jelen levő fehérjék és bilirubin zavaró hatásának kiküszöbölése céljából van szükség), találmányunk sze- 40 rinti reagens esetében a hatékonyabb 5-6 t%-os triklórecetsav oldat is használható, d) a találmány szerinti reagens által létrehozott fotometriálható szín abszorbanciája még 24 óra után is változatlan, 45 e) a mérés során létrehozott reakcióelegyben a reaktáns végkoncentrációja jóval alacsonyabb, mint az eddigi módszereknél (összehasonlításul a Trinder-módszernél a fenol 10 mmól/1, a 188 953 sz. magyar szabadalmi leírás szerinti módszernél 50 a timol 2,3-2,7 mmól/1 körüli koncentrációjú, míg találmányunk esetében az m-krezol végkoncentrációja 1,2 mmól/1 körüli, de legfeljebb 1,5 mmól/1 érték), f) a találmány szerinti reagens igen jól kezelhető vizes 55 oldat, a színreagenset tartalmazó „B”-komponens 2-3 évig is tárolható, bomlás nélkül. A találmány alapján kidolgozott diagnosztikai készlet és annak használatát az alábbi példán mutatjuk be: 60 Elv: A B-O-glükózt a GOD enzim glükonsawá H202-vé oxidálja. A POD a keletkezett H202-vel arányos színes, jól fotometrálható kinoidális terméket képez az m-krezol és 4-amino-antipirinből. Reagensek alap (kezdő) koncentrációi: 1. Színképző I foszfát (Na2HP04 X 2H20+KH 2P04) puffer 160 mmól/1 pH-7,8 4-amino-fenazon 1 mmól/1 (,A”-komponens) nátrium-azid 12,0 mmól/1 2. Enzimek GOD > 10U/ml POD > 15 U/ml 3. Színképzó II (,$”-komponens) -mkrezol vizes oldata 25,5 mmól/1 4. Standard 10 mmól/1 glükóz-oldat A teszt kiszerelése: 4x1 flakon 4x1 literre 4x 15 000 GOB 10 000POD (liofilizált) 2 x 100 ml színképző II. 1 x 10 ml standard. Tárolás: +2 - +8 °C-on. A készlet falhasználható a dobozon feltüntetett időpontig. Reagensek készítése ,A "-komponens: Az 1. sz flakon (Színképző I.) tartalmát feloldjuk 3
