200488. lajstromszámú szabadalom • Eljárás de-mannozil-teikoplanin-származékok előállítására
1 HU 200488 B 2 Glükóz^ 2 g/1 Élesztőkivonat 5 g/1 Aszparagin 1,5 g/1 MgS04 0,5 gn CaC03 5 grí NaCl 0,1 grí CaCl2xH20 0,1 grí Nyomelem oldat 0>) 1 ml/1 pH sterilezés után: 6,9 (a) a glükózt külön sterilezzük (b) a nyomelem oldat összetétele. Bórsav 0,50 g/1 CuS04x5H20 0,04 grí KI 0,10 grí FeCl3x6H20 0,20 g/1 MnSOxH20 0,40 g/1 FeS04x7H20 0,40 g/1 Ammónium molibdát 0,20 g/1 A fenti eljárással harminc lombikot készítünk. 48 óra elteltével 20 mg TA2-2 szubsztrátot (azaz a teikoplanin koplex 2 komponensét) adunk mindegyik lombikhoz, és a fermentációt aerob körülmények között folytatjuk tovább az adagolástól számított 72 órán át. A fermentlé HPLC-s vizsgálatával kimutatható a TA2-2 40 %-nak DM-TA2-2-vé alakulása. Mind a 30 lombikból származó egyesített reakcióelegy pH-ját 10,5-re állítjuk IN NaOH hozzáadásával, majd szűrési segédanyag hozzáadásával leszűrjük. A szűrt lé pH-ját 7,5-re állítjuk IN HC1 hozzáadásával, majd ehhez 150 ml Sepharose-epszilon-aminokaproil-D-Alanil-D-Alanin affinitás gyantát (122 969 sorszámú EPA bejelentés) adunk. Az elegyet éjszakán át 4 °C-on kevertetjük. A gyantát ezután elválasztjuk a kimerített fermentlétől és kromatográfiás oszlopba töltjük. Az oszlopot öt gyanta-térfogatnyi Tris-HCl pufferrel (0,05 M, pH 7,5), majd ugyanilyen térfogatú Trisz-bázis oldattal (0,05 M) mossuk. A gyantát ezután 1 %-os ammónium-hidroxiddal eluáljuk, 100 ml-es frakciókat szedve. A frakciókat hangyasavval semlegesítjük, majd HPLC-vel elemezzük. A HPLC vizsgálatot a következő körülmények között végezzük. Berendezés: Hewlett Packard 1084B modell, 254 nm-es detektorral Oszlop: Erbasil C-18, 5 mikrométer, 4,6 x 150 mm Mozgófázis: A) CH3CN:NaH2P04 (0.02M), 5:95; B) CH3CN:NaH2P04 (0,02M), 75:25; A gradiens profil a következő perc 0 40 45 48 50 %B 8 40 55 8 stop Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc Injektálás: kb. 20 mikroliter a vizsgált anyagot tartalmazó oldatból, kb. 1 mg/ml vízben, vagy H20:CH3CN-ben (1:1) A fenti körülmények között a TA2-2 retenciós ideje (RT) 24,71 perc, míg a DM-TA2-2 RT-je 26,30 perc. A DM-TA2-2 tartalmú frakciókat egyesítjük (kb. 200 ml), majd ultraszűréssel töményítjük 90 mm-es Hi-Flux U-F Cell Millipore berendezést használva, ebben egy PCAC Pellicon ultraszűrő membránnal, amelynek a névleges molekulatömeg határa (NMWL) 1000 dalton. Az oldat térfogatát kb. 20 ml-re csökkentjük, majd a maradékot liofilezve 268 mg nyers DM-TA2-2-t kapunk. A nyersterméket tovább tisztítjuk fél-preparatív HPLC-vel a következő körülmények között: Berendezés: Waters folyadék-kromatográf, kétszivattyús 6000 A modellel ellátva, egy 254 nm-re állított 440-es modellszámú abszorbciós UV detektor, és egy 660-as oldat-programozó modell. Oszlop: HIBAR LiChrosorb RP-18, 7 mikrométer 250 x 10 mm (Merck); Mozgófázis: A) vizes (2 g/1) HCOONH4/CH3CN (9:1) B) vizes (2 g/1) HCOO NH4/CH3CN (3:7); Gradiens: lineáris 5 % B-től 45 % B-ig 45 perc alatt Áramlási sebesség: 6 ml/perc Injektálás: 10 mg termék oldva 2 ml A-ban minden egyes alkalommal. Az eluátumnak azokat a részeit, amelyek a kromatográfiás profil alapján DM-TA2-2-t tartalmaznak, összegyűjtjük. Az ismertetett fél-preparatív tisztítási eljárást alkalmazzuk az ultraszűrés után kapott összes nyerstermékre, az eluátumokat egyesítjük (összesen 180 ml) és a szerves oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A visszamaradó vizes oldatot (DM-TA2-2 oldat) ultraszűréssel 5 ml-re töményítjük az előzőkkel egyező körülmények között, és a visszamaradó oldatot liofilezve 85 mg tiszta, I általános képletű DM-TA2- 2-t kapunk; ahol R = N-(8-metil-nonanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport; Rí = N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil; R2 = hidrogén. A tiszta DM-TA2-2 fH-NMR spektrumát Bruker AM-250 modellel rögzítjük, amely tömb-processzort tartalmaz, 250 MHz-es mágnessel és egy komputerizált Aspect 3000 konzollal működik. A protonokra jellemező spektrumokat DMSO-d6 oldatban vesszük fel 250 “C-on, TMS-t használva referenciaként. A teikoplanin komplexhez hasonlítva a DM-TA2-2 legjellemzőbb jeleit a II. táblázatban közöljük. A DM-TA2-2 gyors-atom bombázásos (FAB) tömegspektrumát FAB forrással ellátott VG 70-70 EQ berendezéssel rögzítjük. A pozitív ionsepktrumot néhány mikroliter tioglicerinben diszpergált mintából kapjuk, amelyet 7 KeV energiájú Ar atomokkal bombázzuk. Ez a kísérlet 1715-ös molekulatömeget mutat, amely egyezik a hozzárendelt szerkezettel. Egy kísérletben, mikor is azonos körülmények között a Nocardia orientalis NRRL 2450 törzset Streptomyces candidus NRRL 3218 törzzsel helyettesítjük, hasonló eredményeket kapunk. Hasonlóképpen járunk el, azonban szubsztrátként TA2-2 helyett 200 mg teikoplamin komplexet használunk. A fermentlevelet a fentiekben ismertetett módon kezeljük és tisztítjuk. A fermentlé konverziós foka 21 %. A HPLC vizsgálatot szintén a fenti módon végezzük, a kapott eredmények az alábbiak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
