200487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új demetil-avermektin-származékok előállítására
1 HU 200487 B 2 A vegyületeket 1 liter 0,1 n sósavban oldjuk. Három lemezről összegyűjtjük a spórákat, és 20 ml 0,05M trisz/maleinsav pufferben, pH=9,0, szuszpendáljuk. 2. lépés: 10 ml spóraszuszpenziót adunk egy kémcsőbe, mely 10 mg N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidint (NTG) tartalmaz. A kémcsövet 28 °C hőmérsékleten rázatjuk 60 percen keresztül, majd a spórákat alaposan kimossuk 1 %-os nátrium-klorid oldattal. 3. lépés: A mosott spórákat 1 %-os nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk, és azonos térfogatú 80 %-os etilén-glikollal keverjük össze. A szuszpenziót -20 °C hőmérsékleten tároljuk, és ezt használjuk sejtforrásként a mutánsok keresésénél. Milliliterenként kb. 104 telepet kapunk. A spóraszuszpenzíóból annyit kenünk fel egy YPD lemezre, hogy lemezenként kb. 100 telepet kapjunk. Az YPD táptalaj összetétele: 10 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 Bacto pepton (Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238, USA), 10 g/1 dextróz és 15 g/1 Bacto agar (Difco Laboratories). 4. lépés: A telepeket 28 °C hőmérsékleten növesztjük 2-3 héten át, majd az egyes telepeket egy szokásos 96 lyukú mikrotiterlemez lyukaiba visszük át. Ugyancsak mindegyik átvitt telepről friss agarlemezre is viszünk, hogy a mutánsok azonosítása után legyenek friss sejtjeink. 5. lépés: A mikrotiterlemez lyukaiba 75 pl M9 pufferoldatot adunk, mely tartalmaz még 1 % glükózt, 0,1 % kazaminosavakat, 0,01 % izovaleriánsavat, 0,01 % izovajsavat és 0,01 % 2-metil-vajsavat is. Miután néhány napon át 28 °C hőmérsékleten inkubáltunk, a sejteket megvizsgáljuk az elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitás szempontjából. Az M9 pufferoldat öszszetétele: literenként 6 g dinátrium-hidrogén-foszfát, 3 g kálium-dihidrogén-foszfát, 0,5 g nátrium-klorid és 1 g ammónium-klorid. Az oldatot sterilezzük, majd sterilen 1 ml 1 M magnézium-szulfát oldatot és 1 ml 0,1 M kalcium-klorid oldatot adunk hozzá. 6. lépés: M9 pufferoldatban rövid ultrahangos kezeléssel emulgeálunk 5 % toluolt. 25 ml emulzióhoz hozzáadunk 1,2 ml, milliliterenként 2,5 mikrocurie [l4C-l]-2-oxo-izokapronsavat tartalmazó oldatot (10 mikrocurie/mikromól). A vizsgálandó telepeket tartalmazó egyes lyukakhoz a fenti keverékből hozzáadunk 50 pl-t. 7. lépés: A titerlemez egyes lyukaiban fejlődő jelzett széndioxidot Tabor és munkatársai [J. Bacteriol., 128:485- 486 (1976)] „Convenient method for detecting 14C02 in multiple samples: application to rapid Screening for mutans" módszerével kötjük meg és mutatjuk ki. Az elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsoknál a kontrolihoz képest nem keletkezik több jelzett bárium-karbonát (Ba14CC>3). Pozitív eredménynél az autoradiogrammon sötét folt jelzi a Ba14C03 keletkezését, negatív eredménynél nincs, vagy csak nagyon gyenge ez a folt. A módszer érzékenyebbé tehető, ha a módszer alábbi módosított változatát alkalmazzuk. A 2-3 hetes növesztés helyett az egyes telepeket 7-14 napos korukban visszük a mikrotiterlemezre és az 5. lépés elhagyásával a 6. és 7. lépés szerint vizsgáljuk őket. A jelzett széndioxid mennyiségi mérésére szolgáló még tovább javított módszernél a mutánsokat olyan M9 pufferoldatban növesztjük, mely 1 % glükózt és 0,1 % „Syncasa-bcaa” készítményt tartalmaz. A „Syncasa-bcaa” körülbelül a kereskedelmi kazaminosavaknak megfelelő L-aminosav keverék, de nem tartalmaz L-valint, L-izoleucint és L-leucint (lásd alább). Miután nagy sejtsűrűségű tenyészetet készítettünk, a sejteket M9 pufferoldattal mossuk és újra szuszpendáljuk 1 % toluolt tartalmazó M9 pufferoldatban. Előzőleg a toluolt ultrahangos kezeléssel tejfehér emulzióvá diszpergáljuk. A sejtek permeabilizálása céljából a sejt/puffer/toluol szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 40 percen keresztül. A permeabilizált sejteket M9 pufferoldattal mossuk és újra szuszpendáljuk az eredetileg alkalmazott térfogat egyötödét kitevő M9 pufferoldatban. 180 pl ilyen szuszpenziót használnak fel a vizsgálathoz. A toluollal kezelt sejteket tartalmazó 300 pl reakciókeverék összetétele: 0,4 mM tiamin-pirofoszfát (TPP), 0,11 mM koenzim-A (CoA), 0,68 mM nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD), 2,6 mM ditiotreitol (DTT), 4,1 mM magnézium-klorid, 60 mM Tris-HCl, pH=7,5 és 6000 cpm [l4C-l]-2-oxo-izokapronsav (mikroCurie/mM). A számlálás hatékonysága 73 %. A reakciót egy 15 ml-es szcintillációs csőben végezzük. melynek kupakjába egy 2x2 cm-es Whatman 4 papímégyzetet szorítottunk. A papírba 30 pl 1 mM Hyamine Hydroxide (1 M metil-benzetonium-hidroxid metanolos oldat; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, USA) itatunk fel, mely a reakció során felszabaduló jelzett széndioxidot megköti. Kétórás inkubálás után a papírt 10 ml Beckman Aquasol II oldatba (Universal LSC, New England Nuclea Research Products, Boston, MA 02118) merítjük, és 4 órás vagy hosszabb kiegyensúlyozódás után mérjük a radioaktivitást folyadék szcintillációs számlálóban. A sejteket nem tartalmazó vak kontroll kb. 50-300 cpm aktivitást mutat. Az 1-3 mutánsnál és a hozzá hasonló mutánsoknál az érték kevesebb vagy azonos a kontrolinál kapott értékkel, míg a szülőtörzs a kontroll értékének többszörösét adja. A HL-026 (ATCC 53568) törzset az alábbiak szerint állítottuk elő az S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzsből. S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzset tápagar lemezen szélesztettünk. Viszonylag nagy számú spontán változat jelent meg, melyek némelyike 4 napos 30 °C hőmérsékleten történő inkubálás elteltével nem fejlesztett légmicéliumot. Izoláltunk néhány ilyen változatot, és megvizsgáltuk ciklopentán-karbonsavat tartalmazó AP-5 közegben fermentálva képesek-e nem-természetes avermektineket termelni. A természetes avermektinektől mentes nem-természetes avermekti-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
