200487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új demetil-avermektin-származékok előállítására
HU 200487 B 2 neket termelő izolátumok közül az egyik törzset, mely a rázott lombikos kísérletek szerint az S. avermitilis 1-3 (ATCC 53576) szülőtörzsnél magasabb avermektintermelő képességgel rendelkezett, HL-026 (ATCC 53568) jelöléssel láttuk el. A „Syncasa-bcaa” készítmény összetétele százszoros koncentrációban literenként: L-alanin 3 g L-arginin 4 g L-aszparaginsav 6 g L-cisztin 1 g L-glutaminsav 20 g glicin 1 g L-hisztidin 2 g L-lizin 7 g L-metionin 3 g L-feni l-alanin 6 g L-prolin 10 g L-szerin 6 g L-treonin 4 g L-tirozin 4 g L-triptofán 1 g Az oldat kémhatását pH=7 értékre -állítjuk be és szűréssel sterilizáljuk. Egy térfogat koncentrátumot adunk 99 térfogatnyi táptalajhoz. A példákban használt táptalajok összetétele: AS-7 táptalaj hidrolizált keményítő0 20 g/1 Ardamine pH* 5 g/1 Pharmamediar 15 g/1 kalcium-karbonát 2 g/1 A kémhatást nátrium-hidroxiddal pH=7,2 énékre állítjuk be. a Bacillus licheniformis-ból származó a-amilázzal hidrolizált keményítő, dextróz-ekvivalens tanalom: 40 % ±5 % (a-amiláz: Novo Enzymes, Wilton, CT; „Termomyl”). h Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012, USA. c Traders Protein., Memphis, TN 38108, USA. AP-5 táptalaj literenként hidrolizált keményítő 80 g Ardamine pH 5 g dikálium-hidrogén-foszfát 1 g magnézium-szulfát-7 víz 1 g nátrium-klorid 1 g kalcium-karbonát 7 s vas(II)-szulfát-7 víz 0;01 g mangán(II)-klorid-7 víz 0,001 g cink-szulfát-7 víz 0,001 g P-2000 habzásgátló 1 ml Az oldat kémhatást 25 %-os nátrium-hidroxiddal pH=6.9 énékre állítjuk be. A HPLC vizsgálatokat az alábbi körülmények között végezzük: Mozgó fázis: 150 ml víz 70 ml acetonitril 1 literre kiegészítve metanollal Oszlop: Ultrasphere ODS, 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100, USA). Áramlási sebesség: 0,75 ml/perc Detektálás: 240 nm-nél Csillapítás (érzékenység): 6 körüli A mintát 35 ml acetontitril és 390 ml metanol elegyével hígítjuk (mintahígító). Standardok: 1. 0,5 mg avermektin A2A-t 10 milliliteres mérőedényben jelig töltve metanollal oldunk. 2. 0,5 mg vizsgálandó anyagot 10 milliliteres mérőedényben jelig töltve metanolban oldunk. Kromatografáláshoz összemérünk 100 pl (1) oldatot, 100 pl (2) oldatot és 800 pl mozgófázist. Mintaelőkészítés: 1. 1 ml fennen tlevet lecentrifugálunk: 2. az üledék felkavarása nélkül leöntjük a felülúszót; 3. az üledékhez hozzáadunk 100 pl HPLC minőségű vizet és felszuszpendáijuk; 4. hozzáadunk a szuszpenzióhoz 2 ml mintahígítót és alaposan összekeverjük; 5. a keveréket leszűrjük és HPLC-vel vizsgáljuk. A fenti HPLC rendszerben megvizsgálva a természetes avermektineket, az egyes avermektinek csúcsainak retenciós idejét a belső standardként használt oligomicin-A retenciós idejéhez viszonyítjuk. Az oligomicin-A csaknem mindig megjelenik, mint melléktermék a S. avermitilis fermentlevében, és az itt ismertetett mutánsok esetében ez az egyetlen, a HPLC kromatogramon megjelenő termék, ha a táptalaj nem tartalmaz RCOOH általános képletű - ahol R jelentése a fentiekben meghatározott - savat, illetve ezzé átalakulni képes vegyületet. Az oligomicin-A retenciós ideje általában 12,5 és 14 perc között van. A retenciós idők aránya sokkal pontosabb az avermektinek azonosítása szempontjából. A HPLC kromatogrammon az avermektin termékek általános sorrendje: B2, A2, B1 és Al. természetes avermektinek avermektin retenciós idő oligomicin-A retenciós idő B2b 0,70 B2a 0,84 A2b 0,90 A2a 1,09 Blb 1,40 Bla 1,83 Alb 1,83 Alá 2,42 Megjegyzendő, hogy a Bla és az Alb nem válnak el egymástól. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
