200486. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektor előállítására
1 HU 200486 A 2 inzulin gént közvetlenül megelőzően beépítünk egy szintetikus, kettős szálú oligonukleotidot, amely 7 db treonin aminosav egymást követő kodonját tartalmazza, és mindkét végén - Cla I restrikciós enzimmel emésztett plazmiddal összekapcsolható - ún. ragadós véget hordoz. Az oligonukleotidot úgy tervezzük meg, hogy helyes orientációjú beépülés esetén a treonin kodonok a proinzulin génnel azonos leolvasási fázisban legyenek, valamint, hogy az oligonukleotidnak csak a génhez közelebbi végén regenerálódjon a Cla I hasítóhely. (Ez utóbbira azért van szükség, hogy a későbbiek során az így keletkezett egyedi Cla I restrikciós helyet felhasználva, a proinzulin gént tetszőleges egyéb peptid génjére cserélhessük.) [Itt jegyezzük meg, hogy a Sung et. al. közlemény (lásd a bevezetőben) állításaival ellentétben a fentiek szerint kapott - továbbiakban Intermedier II - plazmiddal transzformált E. coli kiónoknál nem kaptunk kimutatható expressziót.] Következő lépésben az Intermedier II plazmid egyedi Nsi I restrikciós helyét EcoRI hasítóhellyé alakítjuk. Ennek során Nsi I emésztés után T4 polimeráz enzimmel történő kezeléssel leemésztjük a 3’ túlnyomó végeket, majd a plazmidot újból cirkularizáljuk DNS ligázzal, nagy mennyiségű - polinukleotid kinázzal foszforilált EcoRI linker jelenlétében. Az eredményül kapott plazmidot a továbbiakban Intermedier Ul-nak nevezzük. Továbbá a pER23 PLH4 plazmid egyedi Pvu II helyére - az a-peptid kódoló régió közepébe - szintén beépítünk egy EcoRI linkért, az előzőekhez képest azzal az eltéréssel, hogy itt a T4 polimeráz enzimmel történő kezelés szükségtelen volt, lévén, a PvuII enzim amúgy is tompa véget képez. Ezután az így kapott - továbbiakban Intermedier IV - plazmid EcoRI Hind III helyére klónozzuk az Intermedier III-ból származó EcoRI, Hind ül fragments - ezt a plazmidot továbbiakban Intermedier V-nek nevezzük, mely plazmid releváns régiójának szerkezetét az 1. ábra ismerteti. Következő lépésben az Intermedier V plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd Bal 31 exonukleázzal - az EcoRI helytől mindkét irányban elindulva - deléciósorozatot képezünk. A kapott sorozat azon elemét választjuk ki, amelynél a Bal 31 néhány tucat nukleotidot emésztett le mindkét irányban. Ezáltal csökkentettük az a-peptid kódoló régió és a 7 treonin kodon távolságát. A DNS ligázzal történő recirkularizáció után a kapott plazmidkeveréket E. coli JM 107 törzsbe transzformáljuk és a kiónok közül olyanokat keresünk, melyek nagy mennyiségben expresszálnak egy - a várt mérettartományba eső - idegen fehérjét. [A kapott plazmid pontos meghatározásának érdekében kiválasztottunk egy alkalmas kiónt, és a belőle preparált plazmidon a deléció végpontjait DNS szekvenciaanalízissei határoztuk meg. (A konkrét konstrukciót és szekvenciát a 2/a, 2/b és 3. ábra mutatja.) A termelt fúziós fehérje erősen reagált humán proinzulin fehérjére specifikus ellenanyagokkal.] Végezetül a legutolsó lépésben a proinzulin gént tartalmazó Cla I, Hind III fragmentet a VI/23 PLH4- -ből származó - rcvx miniplazmid eredetű - Cla I, Hind III polilinker fragmentumra cseréljük ki. Vegyszerek és preparátumok Az általánosan használt laboratóriumi vegyszerek alt. minőségű, kereskedelmi forgalomban beszerezhető, RE ANAL, SIGMA és MERCK készítmények voltak. A [_32P ATP és a'32P]dATP preparátumok (Magyar Izotóp Intézet, Budapest) specifikus aktivitása 100— 150 TBq/mM volt A használt PvuII, EcoRI, Hindin, restrikciós endonukleázokat az MTA SZBK Biokémiai Intézet Nukleinsav csoportjának munkatársai tisztították a közölt módszerek alapján [Methods in Enzimology (Ed: L.Grossmann, V. Moldave) Vol. 65. pages 89—180]. A Clal, Nsil enzimek a New England Biolabs készítményei voltak. A BAL31 nukleáz és Klenow-enzim (E. coli DNAP-polimerasel Large Fragment) New England Biolabs, a bakteriális alkalikus foszfatáz (BAP) Worthington, a pankreász RN-áz és lizozim pedig REANAL készítmény volt A T4 indukált polinukleotid ligáz Murray et al. módszere szerint készült [Murray, N.E., Burce S.A. and Murray, K: Molecular cloning of the DNA ligásé gene from bacteriophage T4. J. Mol. Biol. 132 (1979) 493-505], Törzsek E. coli K12 JM107 [Yanisch-Perron, C. és mtsai: Improved Ml3 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp 18 and pUC19 vectors. Gene S3 (1985) 103-119]. Az Escherichia coli törzsek növesztésére használt komplett folyadék táptalaj literenként 10 g Bacto-tryptone-t, 5 g Bacto Yeast extract-ot és 5 g NaCl-ot tartalmazott. Szilárd táptalaj készítéséhez a fenti összetételű médiumot literenként 15 g Bacto-agarral egészítettük ki. A ß-galaktoziddz enzim N-terminális rész (a-peptid) expressziójának becslésére alkalmas indikátor lemezek összetétele literenként: 20 g casaminosav 6g Na2HP04 3g KH2PO4 0,5 g NaCl 1 g NH4CI 15 g Bacto-Agar 20 mg X-gal (dimetil-formamidban oldva) 2mM MgCh 0,1 mM CaCl2 A ß-lactamdz gént kódoló plazmidot tartalmazó sejteket 100 pg/ml koncentrációban ampicillint tartalmazó táptalajon növesztettük. Plazmid DNS izolálásához a megfelelő plazmidot tartalmazó baktérium törzset 100 pg/ml ampicillint tartalmazó táptalajon tenyésztettük és ODóoOnm 0,7- 0,8 elérésekor 170 |ig/ml kloramfenikolt adtunk a kultúrához a plazmid amplifikálására. Preparatív méretekben történő plazmid DNS izoláláskor a Clewell és Helinski által leírt módszerrel clear lizátumot készítettünk [Clewell, D.B. and Helinski, D.R., (1969) Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular RNA form. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 62, 1159-1166], majd a plazmid DNS-t Sephacryl SI000 (Pharmacia) oszlopon vagy cézium-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
