200486. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektor előállítására
1 HU 200486 A 2 klorid-ethidiumbromid sűrűség gradiensben ultracentrifugálva tisztítottuk. Analitikai méretekben történő plazmid DNS izolálásra (1,0-1,5 ml baktérium kultúrából) a Bimbóim és Doly által kidolgozott és D. Ish-Horowicz által módosított kálium-acetátos módszert alkalmaztuk [Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New Yoric]. DNS minták hasítása restrikciós endonukleázokkal a New England Biolabs által javasolt reakció körülmények között történt Ragadós végű DNS fragmentumok összekapcsolásakor a reakcióelegy (30-40 p.1) 0,5-1,0 |ig DNS-t, 66 mM Tris-HCl-t (pH 7,6), 5 mM MgCh-ot, 5 mM dithiothreitolt, 1 mM ATP-t és 1 egység T4 indukált polinukleotid ligázt tartalmazott. A ligálást 2-3 órán át, 14 °C-on végeztük [Maniatis T„ Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York]. Tompa végű fragmentumok összekapcsolása 30-40 [Xg/ml DNS, 25 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM MgCte, 5 mM dithiothreitol, 0,25 mM spermidin, 1 mM ATP, 10 jig/ml BSA (Sigma, Type V) összetételű pufferben történt A reakcióelegyhez 4-6 egység T4 indukált polinukleotid ligázt adtunk, és 8—12 órán át 14 °C-on inkubáltuk. DNS minták gélelektroforézisét 0,8-2,0 %-os agaróz gélekben (Sigma, Type I), horizontális elektroforézis készülékekben a Helling és mtsai által leírt (1974) módon végeztük. A poliakrilamid gélelektroforézis - 4 és 8 %-os, 1 mm vastag, vertikális géleket alkalmazva - a Maniatis, X, Jeffrey, A. and van de Sande, H. (1975) [Chain length determination of small double and single-stranded DNS molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry 14, 3787-3794] által közölt recept szerint történt. DNS fragmentumok izolálására agaróz és poliakrilamid gélekből Winberg G., Hammarskjöld, M. (1980) [Isolation of DNA from agarose gels using DEAE-paper. Application to restriction site mapping of adenovirus type 16 DNA. NAR, 8, 253] DEAE papírt alkalmazó módszerét használtuk. BAL31 nukleázzal a DNS fragmentumokat 100 pg/pl végkoncentrációban, 600 mM NaCl, 12 mM CaCb, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM EDTA összetételű reakcióelegyben 30 *C-on emésztettük. A megkívánt rövidítés mértékétől függően 1,0 [tg DNS- hez 0,4-1,2 egység enzimet adtunk. Minden esetben az adott DNS fragmentummal és a rendelkezésre álló BAL31 enzimpreparátummal teszt reakciót készítettünk, amelyben különböző idejű inkubálás után vett minták gélelektroforetikus analízisével meghatároztuk a fragmentum megrövidülésének mértékét. Az enzim működését a reakcióelegy fenolos extrakciójával állítottuk le, és a DNS etanolos kicsapása után a végeket a 3’ végek jelölésére alkalmas reakciókörülmények között Klenow polimerázzal tompa végekre javítottuk [Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York]. Kompetens sejteket a JM107 baktériumtörzs transzformációjához a Mandel és Higa által közölt [Maniatis, X, Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York] CaCl2- os eljárással készítettünk. DNS fragmentumok 5’ végeinek defoszforilása, végjelölése polinukleotid kinázzal és --P ATP-vel és a nukleotid szekvencia meghatározása a Maxam, A. and Gilbert, W. (1980) [Sequencing end-labeled DNA with basespecific chemical cleavages. Meth. Enzymol. 65 499-560] által leírt protokoll szerint történik. Az inzulin tartalmú fúziós fehérjét immunobiot módszerrel mutattuk ki (Towbin et. al.: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to introcellulose sheets: Procedure and some applications, Proc.Nat.Acad.Sci. USA^ 76:4350, 1979). Az expressziós vektorok előállításához használt egyéb módszerek és eljárások alkalmazásakor a Maniatis X, Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York] által leírt útmutatásokat követtük. Deponálási adatok: Deponált törzs jele Deponálási szám Deponálás dátuma y 1090/pszI. 153 NCAIM 1064 1988. július 13. 8 óra 50 perc JM 107/pER 23 NCAIM 1059 1988. július 13. Threo-alfa 8 óra 50 perc Hivatkozási jelek listája Pr : promoter T1T2: transzkripciós terminátorok sp : spacer régió sd : Shine-Dalgamo szekvencia (riboszómakötőhely) aa : aminósav op : lac operátor V : delécióképzés (Bal 31 exonukleázzal) nu : nukleotid thr : threonin kodonok őri : replikációs origó a : alpha-peptid gén h.p.i.: humán proinzulin gén ApR : ampicillin rezisztenciát biztosító béta-laktamáz gén E : Eco Rí restrikciós enzim Ba : Bam Hl restrikciós enzim Pst : Pst I restrikciós enzim Bg : Bgl II restrikciós enzim X : Xba I restrikciós enzim H : Hind III restrikciós enzim SZABADALMI IGÉNYPONXOK 1. Eljárás expressziós vektornak a pER VI/23 vektorcsalád valamely tagjából kiinduló előállítására homopolimer aminosavrészt kódoló szekvencia beépítésével, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott plazmid-vektomak a promóter, operátor, riboszómakötőhely és transzlációs startkodon régiói után - az expresszáltatni kívánt gén elé - egy 15-20 aminosavnyi ß-galaktozidaz részt kódoló szekvenciát, az operátor szekvencia, vagy annak valamely részlete megismétlését, újabb riboszómakötőhelyet, transzlációs startkodont, egy 5-10 aminosavnyi homopolimer aminosavrészt kódoló szekvenciát, majd egy újabb ATG-kodont építünk be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
