200480. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az alpha-melanotropin nyíltláncú és gyűrűs analógjai előállítására
HU 200480 B - a triptofán indol-gyűrűrendszerének nitrogénatomját formilcsoporttal;- az arginin guanidinocsoportjának nitrogénatomját p-toluol-szulfonil-csoporttal;- a hisztidin imidazolgyűrűjének nitrogénatomját 5 p-toluol-szulfonil-csoporttal; és- a glutaminsav gamma-helyzetű karboxilcsoportját és az aszparaginsav ß-helyzetü karboxilcsoportját benzil-észter formájában. A tercier-butoxi-karbonil-csoportot mint az ami- 10 nocsoport védőcsoportját úgy távolítjuk el, hogy a védett anyagot 2 % anizolt is tartalmazó, 48 %-os diklór-metános trifluor-ecetsav-oldattal kezeljük, mégpedig kétszer, az első kezelés 5 percig, a második pedig 20 percig tart. 15 Az egyes aminosavakat egymás után hozzákapcsoljuk a gyantához kötött peptidlánchoz, ezt minden egyes aminosavval az alábbi műveletsor végrehajtása útján végezzük el: 1. a gyantát négyszer 30 ml diklór-metánnal 1-1 20 percig mossuk, 2. a tercier-butoxi-karbonil-csoportot 2 % anizolt is tartalmazó, 48 %-os diklór-metános trifluor-ecetsav-oldat kétszeri alkalmazásával lehasítjuk, az első kezelés időtartama 5 perc, a másodiké 20 perc, 25 3. a gyantát kétszer 30 ml diklór-metánnal mossuk, 4. a gyantát kétszer 30 ml 10 %-os diklór-metános diizopropil-etil-amin-oldattal 3-3 percig kezelve semlegesítjük, 30 5. a gyantát háromszor 30 ml diklór-metánnal 2- -2 percig mossuk, 6. a gyantához hozzáadjuk a tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett aminosav-származék 20 ml diklór-metánnal készült oldatát (kivéve a triptofánt, ar- 35 ginint és hisztidint, amely esetekben az oldhatósági problémák miatt a diklór-metán helyett oldószerként dimetil-formamidot használunk), majd az elegyhez hozzáadjuk az 1-hidroxi-benzotriazolt, és ezután a diciklohexil-karbodiimidet, és az így kapott elegyet 40 1-3 órán át rázatjuk, 7. a gyantát háromszor 30 ml diklór-metánnal 2- -2 percig mossuk, és a gyantát háromszor 30 ml 100 %-os etanollal 2- -2 percig mossuk. A kapcsolási reakció előrehaladását a fent leírt módon követjük, majd az utolsó aminosav hozzákapcsolása után a a-amino-csoporthoz kapcsolódó tercier-butoxi-karbonil-csoportot lehasítjuk. Ezután az aminocsoportot semlegesítjük, és diklór-metánban N-acetil-imidazol tízszeres fölöslegével, vagy ugyancsak diklór-metánban, ecetsav-anhidrid és piridin 1:1 arányú elegyének kétszeres fölöslegével (reakcióidő: 1 óra) megacetilezzük. A védőcsoportok lehasítása és a peptidláncnak a gyantáról való lehasítása céljából a védett peptidláncot hordozó gyantát 0 °C hőmérsékleten 45 percig egy olyan eleggyel kezeljük, amely 82 % vízmentes, cseppfolyós fluor-hidrogénsavból, 10 % anizolból és 8 % 1,2-etán-ditiolból áll (1 g gyantához 10 ml ilyen elegyet használunk). A reakció lejátszódása után az illékony részeket csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a szabad peptidet háromszor 30 ml dietil-éterrel vagy etil-acetáttal mossuk, háromszor 30 ml 30 %-os, vizes ecetsav-oldattal, és ezután háromszor 30 ml desztillált vízzel kivonatoljuk. Az egyesített vizes kivonatokat fagyasztva szárítjuk, ily módon fehérszínű, porszerű anyag formájában a nyers peptidet kapjuk. Az így kapott peptideket egy kation-cserélő karboxi-metil-cellulózzal töltött oszlopon kromatografálva tisztítjuk, szakaszos gradiens elúcióval, e célra először 250 ml 0,01 mólos ammónium-acetát-oldatot (pH=4,5). utána 250 ml 0,01 mólos ammónium-acetát-oldatot (pH=6,8), ezután 250 ml 0,1 mólos ammónium-acetát-oldatot (pH=6,8), és végül 250 ml 0,2 mólos ammónium-acetát-oldatot (pH=6,8) használunk. A főterméket (amelyet 280 nm hullámhossznál követünk) a 0,01 mólos ammónium-acetát-oldat (pH=6,8) utolsó részlete, és a 0,1 mólos ammónium-acetát-oldat (pH=6,8) első fele között eluáljuk. A megfelelő frakciókat fagyasztva szárítjuk, ily módon fehér színű, porszerű anyag formájában kapjuk a tisztított peptidet. Az a-melanotropinnak a jelen találmány szerinti, gyűrűs analógjait az alábbi táblázatokban foglaljuk össze: Az a-melanotropin és gyűrűs analógjainak szerkezete SORSZÁM Primer Szekvencia 16. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NHi 17. Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2 18. Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2 19. Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2 20. Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH2 21. Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH2 22. Ac- Nie- Asp-Hi s-D-Phe- Arg-Tip- Dpr-NH2 10
