200480. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az alpha-melanotropin nyíltláncú és gyűrűs analógjai előállítására
HU 200480 B 2 SORSZÁM Analóg képlet 16. alfa-MSH 17. Ac-[Nle4, GÍu5, D-Phe7, Lys10, Glyll]-alfa-MSH4-i3NH2 18. Ac-[Nle4, GÍu5, D-Phe7, Lys10]-alfa-MSH4-ioNH2 19. Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, L}s10]-alfa-MSH4-ioNH2 20. Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Om'°]-alfa-MSH4-ioNH2 21. Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dab10]-alfa-MSH4-ioNH2 22. Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Drplo]-alfa-MSH4-ioNH2 Az <x-melanotropin gyűrűs analóg fragmenseinek 15 a jelen találmány szerinti előállítását a továbbiakban - a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül - példákkal szemléltetjük. 11. példa |----------------1 20 Ac-[NLe4,Glu5,D-Phe7Mysw,Glyn ]-a-MSH4-i 3NH2 A cím szerinti vegyület védett, gyantához kötött formáját úgy állítjuk elő, hogy 1,0 g Na-Boc-Val-p-MBHA képletű gyantához, tehát az oc-amino-csoporton terei- 25 er-butoxi-karbonil-csoporttal védett valint hordozó pmetil-benzhidril-amin-típusú gyantához, amely grammonként 0,7 mmól, az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett valint tartalmaz, stepwise módszerrel, az alábbi sorrendben hozzákapcsol- 30 juk a következő, az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett aminosavakat:- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett prolin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett glicin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal és az epszilon-amino-csoporton 2,4-diklór-benziloxi-karbonil-csoporttal védett lizin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal és az indol-gyűrűrendszer nitrogénatomján formilcsoporttal védett triptofán,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal és a guanidinocsoporton p-toluol-szulfonil-csoporttal védett arginin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett D-fenil-alanin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal és a imidazolgyűrű nitrogénatomján p-toluol-szulfonil-csoporttal védett hisztidin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonif-csoporttal védett glutaminsav-gamma-benzil-észter, és- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett norleucin. 35 40 45 50 55 Az utolsó aminosav hozzákapcsolása után az a-amino-csoporthoz kapcsolódó tercier-butoxi-karbonil-csoportot lehasítjuk, az aminocsoportot semlege- 60 sítjük. majd diklór-metánban N-acetil-imidazol tízszeres fölöslegével (reakcióidő: 6-8 óra), vagy ugyancsak diklór-metánban. ecetsav-anhidrid és piridin 1:1 arányú elegyének kétszeres fölöslegével (reakcióidő: 1-2 óra) megacetilezzük. Ily módon az 65 Ac-Nle-Glu(garnrna-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe--Arg(NS-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Ne-2,4-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA képletű, védett peptidet hordozó gyantát kapjuk. Ennek a terméknek egy 1,0 g (0,6 mmól) súlyú részletét 1 ml anizol és 0,8 ml 1,2-etán-ditiol jelenlétében 10 ml vízmentes fluor-hidrogénsavval kezeljük 0 °C hőmérsékleten, 45 percig. Ezután a fluor-hidrogénsavat, anizolt és az 1,2-etán-ditiolt csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a megszárított terméket háromszor 30 ml dietil-éterrel mossuk, majd háromszor 30 ml 30 %-os ecetsavval kivonatoljuk. A peptid vizes kivonatát fagyasztva szárítjuk, ily módon fehér színű, porszerű anyag formájában 325 mg nyers, Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2 képletű peptidet kapunk. A nyers Ac-[Nle^,D-Phe7,Lys10,Glyll]-a-MSH4-13NH2 képletű analóg egy 150 mg súlyú részletét megtisztítjuk. E célból a nyers peptidnek ezt a mintáját feloldjuk 2-4 ml 0,01 mólos ammónium-acetát-oldatban (pH=4,5), és egy 2,0 x 25,0 cm méretű, karboxi-metil-cellulózzal töltött oszlopon kromatografáljuk, szakaszos gradiens elúcióval. Eluensként először 250 ml 0,01 mólos (pH=4,5), ezután 250 ml 0,01 mólos (pH=6,8), és végül 250 ml 0,2 mólos (pH=6,8) ammónium-acetát-oldatot használunk. A főterméket 280 nm hullámhossznál végzett méréssel követjük, ez a termék a 0,1 mólos (pH=6,8) ammónium-acetát puffer-oldat első felével jön le az oszlopról. A megfelelő reakciókat fagyasztva szárítjuk, ily módon 104 mg fehér színű, porszerű anyagot kapunk. A karboxi-metil-cellulózon végzett kromatografálás szerint tiszta Ac-[NLe4,D-Phe7,Lys10,GÍy11]-ot-MSH4-i3NH2 képletű peptidet nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás módszerrel tovább tisztítjuk, e célra egy 25 cm x 25 mm méretű, Vydac 218TP15— 16 CisRP fordított fázisú szilikagéllel töltött, félpreparatív oszlopot használunk, eluensként pedig 0,1 %-os trifluor-ecetsavas pufferoldatot és acetonitrilt alkalmazunk. 100 mg peptidet nagyfelbontású folyadék-kromatográfiával tisztítva 74 ma tiszta, Ac-[Nle4,D-Phe7,Lys1 °,Gly11 ]-a-MSH4-i 3NH2 képletű peptidet kapunk. A tiszta Ac-[Nle4,D-Phe7,Lys10.Glyn]-a-MSH4-i3 képletű peptid egy 40 mg súlyú mintáját feloldjuk 1 ml 5 %-os, vizes sósavban, és az oldatot egy 1.0 x 15,0 cm méretű, dietil-amino-etil-cellulóz-hidrokloriddal töltött oszlopon kromatografáljuk, eluensként 100 ml 5 %-os, vizes sósavat használunk, és a frak-
