200480. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az alpha-melanotropin nyíltláncú és gyűrűs analógjai előállítására
1 HU 200480 B 2 tidláncot cseppfolyós fluor-hidrogénsav segítségével hasítjuk le a gyantáról. A hasítás után a reakcióelegy illékony részeit 0 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékot megszárítjuk, utána háromszor 3 ml dietil-éterrel mossuk, ezután háromszor 30 ml 30 %-os, vizes ecetsavval kivonatoljuk, és az oldatot fagyasztva szárítjuk. Az ily módon porszerű anyag formájában kapott, 530 mg súlyú pepiidet két, egyenként 260 mg súlyú részre osztjuk. Az egyik részt feloldjuk 1,5 ml ammónium-acetát puffer-oldatban (pH=4,5), az oldatot egy szűrőbetéten át leszűrve felvisszük egy 2,0x30,0 cm méretű, karboxil-metil-cellulózzal töltött oszlop tetejére. Az oszlopot 250-250 ml 0,01 mólos (pH=4,5), 0,1 mólos (pH=6,8) és 0,2 mólos (pH=6,8) ammónium-acetát-oldattal eluáljuk. A főterméket 280 nm hullámhossznál mutatjuk ki, eszerint ez a termék a 0,1 mólos ammónium-acetát-oldat vége, és a 0,2 mólos ammónium-acetát-oldat első fele között jön le az oszlopról. Ezeket a frakciókat fagyasztva szárítjuk, ily módon 142,3 mg fehérszínű, porszerű anyagot kapunk. E pepiidnek egy 80,0 mg súlyú részletét preparatív nagyfelbontású folyadék-kromatográfiával tisztítjuk. A fő összetevőt tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, ily módon 63 mg cím szerinti peptidet kapunk. [0t]54623= -51,6° (c=0,31, 10 % ecetsav), Rp=0,34 [1-butanol/ecetsav/piridin/víz (5:5:1:4 tf)]. 2. példa Ac-[Nle4,Asp5,D-Phe7,Lysl0,Gly11 J-a-MSHi-ijNHi A cím szerinti vegyületet úgy állítjuk elő, hogy 1,0 2 (körülbelül 0.5 mmól) Na-Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(N?-Tos)-Trp (N‘-For)-Lys(N£-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA képletű, gyantához kötőn, védett peptidhez stepwise módszerrel hozzákapcsoljuk az alábbi aminosavakat:- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett aszparaginsav-ß-benzil-dszter,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett norleucin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett szerin-O-benzil-éter,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal, és a fenolos hidroxilcsoporton 2-bróm-benziloxi-karbonil-csoporttal védett tirozin, és- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett szerin-O-benzil-éter. A kapcsolást valamennyi aminosavval a fent említett módon hajtjuk végre. A gyantához kötött, védett tridekapeptidet - az N-terminálison levő tercier-butoxi-karbonil-csoport lehasítása és semlegesítés után - diklór-metánban N-acetil-imidazol tízszeres fölöslegével acetilezzük (reakcióidő: 5 óra). A kapott terméket csökkentett nyomáson megszárítjuk, ily módon 1,8 g Ac-Ser(0-Bzl)-Tyr(0-2-BrZ)-Ser(0-Bzl)-Nle-Asp (ß-Bzl)-His(N'-Tos)-D-Phe-Arg-(NS-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(NE-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA képletű, védett peptidláncot hordozó gyantát kapunk. 1,0 g ily módon kapott, védett peptidláncot hordozó gyantát cseppfolyós fluor-hidrogénsavvai kezelünk, az illékony részeket ledesztilláljuk, a maradékot háromszor 30 ml dietil-éterrel mossuk, a peptidet háromszor 30 ml 30 %-os, vizes ecetsavval kivonatoljuk, és az oldatot fagyasztva szárítjuk. A nyers tridekapeptid egy 200 mg súlyú részletét feloldjuk 1,5 ml ammónium-acetát puffer-oldatban (pH=4,5), egy szűrőbetéten át leszűrve felvisszük egy 2,0 x 30,0 cm méretű, karboxi-metil-cellulózzal töltött oszlop tetejére. Az oszlopot az 1. példában leírt módon, ammónium-acetáttal, szakaszos gradiens elúcióval eluáljuk. Ily módon, a megfelelő frakciókat fagyasztva szárítva 152 mg peptidet különítünk el. Ennek a nyers pepiidnek egy 100 mg súlyú részletét nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás módszerrel tovább tisztítjuk, ily módon 67 mg cím szerinti peptidet kapunk. [tx]5462 - -52,3° (c=0,33, 10 % ecetsav), Rf=0,32 [1-butanol/ecetsav/piridin/víz (5:5:1:4 tf)] 3. példa Ac-[Nle4,D-Phe7Zysl0,GIy,l]—a-MSH4-i3NH2 A cím szerinti peptidet a szilárd fázisú módszerrel, úgy állítjuk elő, hogy 1,0 g (0,5 mmól) Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(NS-Tos)-Trp (N'-For)-Lys(NE-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA képletű gyantához stepwise módszerrel hozzákapcsolunk először az a-amino-csoportján tercier-butoxikarbonil-csoporttal védett glutaminsav-gamma-benzil-észtert, majd ezután az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett norleucint. A kapcsolást mindkét aminosavval a fenti példákban leírt módon hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy az N-terminálist ecetsav-anhidrid és piridin 1:1 arányú elegyének kétszeres fölöslegével, diklór-metánban, 1 órás reakcióidővel acetilezzük meg. A 4-es számú peptidet a 2. példában leírt módon tisztítva fehérszínű, porszerű anyag formájában, 22 %-os hozammal kapjuk. [a]54623= —49; 14° (c=0,35, 10 % ecetsav) Rf=0,43 [ 1 -butanol/ecetsav/piridin/víz (5:5:1:4 tf)]. 4. példa Ac-[Nle4Asp5,D-Phe7jLysl0,Glyll]-<x-MSH4-l3NH2 A cím szerinti peptidet úgy állítjuk elő, hogy 1.0 g (körülbelül 0,5 mmól), az 1. példában leírt módon előállított, Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(N8-Tos)-Trp (N‘-For)-Lys-(N£-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA képletű, gyantához kötött, védett peptidhez stepwise módszerrel hozzákapcsolunk először az a-amino-csoportján tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett aszparaginsav-ß-benzil-dsztert, majd ezután az a-amino-csoportján tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett norleucint. Az így kapott, gyantához kötött, védett peptidet az 1. példában leírt módon dolgozzuk fel. A nyersterméket először az 1. példában leírt módon karboxi-metil-cellulózon kromatografáljuk. majd a kapott, 130 mg súlyú terméket nagyfelbontású folyadék-kromatográfiával tovább tisztítjuk. Ily módon 53 mg tiszta peptidet kapunk. [oc]54623= -50,0° (c=0,32, 10 % ecetsav) Rf=0,41 [ 1 -butanol/ecetsav/piridin/víz (5:5:1:4 tf)]. 5. példa Ac-[Nle4,D-Phe7,Lyslo]-a-MSH4-loNH2 2,7 g p-metil-benzhidril-amin-típusú gyantát (amely grammonként 0,7 mmól aminocsoportot tar5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
