200480. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az alpha-melanotropin nyíltláncú és gyűrűs analógjai előállítására
HU 200480 B 2 Az agyalapi mirigyből elkülönített a-melanotropinnal rokonszerkezetű peptidekkel végzett összes korábbi vizsgálat azt mutatta, hogy mindezen peptidek változatlanul tartalmazzák a hatásért felelős Met4-GIu5-His6-Phe7-Arg8-Trp9-Gly10 szekvenciát (vagyis a metionin-glutaminsav-hisztidin-fenil-alanin-arginin-triptofán-glicin szerkezeti elemet). A korábbi eredmények azt valószínűsítették, hogy a proopio-melanokortinból leszármaztatható hormonokban ez a heptapeptid a hatásért felelős részét. Az a-melanotropin, valamint analógjai és fragmensei szerkezetének és biológiai hatásának összefüggéseit in vitro (az élő szervezeten kívüli) rendszerben, békabőrön vizsgálva kitűnik, hogy ezeknek a vegyületeknek a hatásáért felelős része közös, és ez a megfelelően módosított Ac-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-NH2 szerkezeti elem. Ezt a fragmenst (jelölése: a-MSH4-io) szintetikus úton előállították, és megvizsgálták, serkenti-e a béka bőrében a melanociták működését. Kimutatták, hogy ez a fragmens a természetes, teljes hormonhoz képest gyenge agonista (azonos hatást kifejtő) hatóanyag. A jelen találmány megalkotása előtt nem vizsgálták viszont, milyen hatással jár, ha (az a-melanotropin eredeti számozása szerint) a peptidlánc 5-ös helyzetében levő glutaminsav és a 10-es helyzetben levő glicin helyén más aminosav áll. Korábbi kutatások (lásd a 4,457,864 és a 4,485,039 számú amerikai szabadalmi leírást), amelyek a jelen találmány szerinti vegyületek kutatásához is alapul szolgálnak, felderítették, hogy ha a hatásért felelős nyíltláncú heptapeptidben a metionint norleucinra cserélik, akkor az a-melanotropin erős hatású analógjához jutnak. Ezenkívül, a peptidlánc 7-es helyzetében levő fenil-alanin cseréje az antipód (enantiomer) D-fenil-alaninra egy biológiailag hatásosabb analóghoz vezetett, amelynek mindkét használatos (a béka bőrén és a gyík bőrén végzett) biológiai meghatározási módszer szerint időben elnyújtott hatása van. E korábbi kutatások néhány eredményét az alábbi táblázatban foglaljuk össze: Az a-melanotropin egyes fragmenseinek biológiai hatása a béka (Rana pipiens) és a gyík (Anolis caroiinensis) bőrén végzett meghatározások szerint PEPTID Relatív hatékonyság béka gyík a-MSH 1,0 1,0 Ac-[Nle4,D-Phe7]-a-MSHi-BNH2 60,0 5,0 Ac-a-MSH4-ioNH2 0,0003 0,004 Ac-[Nle4)-a-MSH4_ioNH2 0,002 0,06 Ac-[Nle4]-a-MSH4-i 1NH2 0,002 1,0 Ac-[Nle4,D-Phe7]-a-MSH4-ioNH2 0,02 10,0 Ac-[Nle4,D-Phe7]-a-MSH4-i 1NH2 0,16 8,0 A fenti táblázatban szereplő rövidítések jelentését lásd a példák előtti felsorolásban. A szerkezet-hatás összefüggések e vizsgálata két fontos eredményt hozott: 1. az oxidálható oldalláncot tartalmazó metionint az oxidációval szemben érzéketlen norleucinra. tehát a metionin egyik izosztérjére cserélve az így kapott peptid-fragmens biológiai hatása az eredetinek körülbelül 10-szerese, 2. a peptidlánc 7-es helyzetében levő L-fenil-alanin helyére D-fenil-alanint beépítve, és a 11 -es helyzetű lizint megtartva, az a-melanotropin hatása tovább erősíthető. Az a-melanotropin nyíltláncú analógjain kívül korábban már előállították az a-melanotropin bizonyos, rögzített konformációjú analógjait, és megvizsgálták ezek biológiai hatását is. Az első ilyen megvizsgált analóg a [Cys4,Cys'°]-a-MSHi-i3NH2 képlettel jellemezhető vegyület volt (tehát az a-melanotropin azon analógjai, amely a peptidlánc 4-es és 10-es helyzetében ciszteint tartalmaz, e két ciszteint oxidációs úton kialakított diszulfid-híd köti össze, és ezáltal gyűrűs szerkezet alakul ki), amelynek hatása a természetes eredetű a-melanotropinhoz képest a béka bőrén mérve körülbelü 10-20-szoros, a gyík bőrén mérve pedig körülbelül kétszeres volt. Az a-melanotropjn e korábbi gyűrűs analógjait azon megfontolások alapján tervezték meg és állították elő, hogy az a-melanotropinban a hatásért felelős rész középső részlete (His6-Phe7-Arg8-Trp9) úgynevezett „Beta-tum” (nem-helikális kanyar) térszerkezetű, és ez a konformációs elrendeződés lényeges a biológiai hatás szempontjából. Az a-melanotropin gyűrűs analógjai szerkezet-hatás összefüggéseinek e klasszikus vizsgálataiból több következtetést lehetett levonni: 1. a peptidlánc 4-es helyzete (metionin) és a 10- es helyzete (glicin) között izosztér (cisztein) helyettesítés útján gyűrűt zárva a melanociták aktivitása a béka bőrén végzett mérés szerint legalább tízszeresre, a gyík bőrén végzett mérés szerint pedig legalább kétszeresre nő, 2. e gyűrűs analógokban a 7-es helyzetű fenil-alanin helyére D-fenil-alanint beépítve a kapott analóg hatása a béka bőrén végzett mérés szerint kétszeres, a gyík bőrén végzett mérés szerint négyszeres, 3. a 11-es helyzetben lizint tartalmazó analógok hatása mindig erősebb, mint az ezen a helyen más aminosavat tartalmazó vegyületeké, és 4. ha a diszulfid-híd révén kialakított 23-tagú gyűrű helyett nagyobb vagy kisebb gyűrűtagszámú analógokat állítunk elő, akkor e kapott vegyületek biológiai hatása lényegesen gyengébb lesz. Az a-melanotropin e gyűrűs analógjaival végzett ezen korábbi vizsgálatok eredményeit a következő táblázatban foglaljuk össze: Az a-melanotropin gyűrűs analógjainak relatív biológiai hatása a béka bőrén és a gyík bőrén végzett in vitro vizsgálatok szerint Peptid-analóg Hatékonyság* béka gyík Az aminosavak helyettesítésének hatása a-MSH 1,0 1.0 [Cys4,CysI0]-a-MSHi_i3NH2 10.0 2.0 Ac-[Cys4,Cysl0]-a-MSH4-i3NH2 30.0 0.6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
