200480. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az alpha-melanotropin nyíltláncú és gyűrűs analógjai előállítására
HU 200480 B T A reakcióelegy feldolgozása során 318,2 mg nyers Ac-[Nle4,Asp5,D-Phe7,Dab10]-a-MSH4-ioNH2 képletű terméket kapunk. E nyers heptapeptid egy 100.0 mg súlyú mintáját megtisztítva fehér színű, porszerű anyag formájában 78,2 mg nyíltláncú peptidet kapunk. A tiszta Ac-[Nle4,Asp5,D-Phe7.Dab10]-a-MSH4-toNH2 képletű peptid egy 45.0 mg súlyú részletét a fent leírt módon gyűrűbe zárjuk, és a kapott terméket ugyancsak a fent leírt módon megtisztítjuk, ily módon 13,2 mg tiszta_______ Ac- [Nle4,Asp5,D-Phe7,Dab10]-a-MSH4-i 0NH2 képletű terméket kapunk. [oc]58922= -54.5° (c=0,01, 10 % ecetsav), Rf=0.80 [ 1 -butanol/ecetsav/piridin/víz (15:3:10:12 tf)]. 16. példa |___________! Ac-[Nle4.Asp-\D-Phe7.Dpr,0]-a-MSH4-ioNH2 1.0 g (0,7 mmól/g) p-metil-benzhidril-amin gyantához a szilárd fázisú peptid-szintézisre a fentiekben általánosságban lein műveletsor végrehajtásával hozzákapcsolunk az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal, és a ß-amino-csoporton benziloxi-karbonil-csoporttal védett 2,3-diamino-propionsavat. A kapcsolási reakciót 1 órás reagáltatás után leállítjuk, a gyantát kimossuk, semlegesítjük, és a gyanta reagálatlan aminocsoportjait ecetsav-anhidrid és piridin 1:1 arányú elegyének kétszeres fölöslegével, diklór-metánban, 1 órás reakcióidővel megacetilezzük. Ezután a gyantához stepwise módszerrel, az alábbi sorrendben hozzákapcsoljuk a következő aminosavakat:- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal, és az indol-gyűrűrendszer nitrogénatomján formilcsoporttal védett triptofán,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal, és a guanidinocsoporton p-toluol-szulfonil-csoporttal védett arginin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett D-fenil-alanin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal, és az imidazolgyűrű nitrogénatomján p-toluol-szulfonil-csoporttal védett hisztidin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett aszparaginsay-p-benzil-észter, és- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett norleucin. Az utolsó aminosav hozzákapcsolása után az a-amino-csoportot védő tercier-butoxi-karbonil-csoportot lehasítjuk, az N-terminális aminocsoportot semlegesítjük, és a 11. példában leírt módon megacetilezzük. Ily módon az Ac-Nle-Asp(ß-Bzl)-His(N'm-Tbs)-D-Phe-Arg (N§-Tos)-Trp(N'-For)-Dpr(ß-Z)-p-MBHA képletű, védett peptidláncot hordozó gyantát kapjuk. Ezt a terméket csökkentett nyomáson megszárítjuk. majd egy 1,0 g súlyú részletét hasítási reakcióba visszük, és a reakcióelegyet az 1. példában leírt módon dolgozzuk fel. Ily módon 310,8 mg nyers, Ac-[Nle .Asp-^.D-Phe ,Dprlo]-a-MSH4_ioNH2 képletű terméket kapunk. A nyers heptapeptid egy 115.0 mg súlyú mintáját all. példában leírt módon megtisztítjuk, ily módon fehérszínű, porszerű anyag formájában 82,5 mg nyíltláncú peptidet kapunk. A tiszta Ac-[Nle4,Asp5,D-Phe7,Dpr!0]-a-MSH4-ioNH2 képletű vegyület egy 38,3 g súlyú részletét gyűrűbe zárjuk és megtisztítjuk, mégpedig a fent leírt módon, ily módon 11,3 mg tiszta Ac-tNle4,Asp5,D-Phe7,Dpr10]-a-MSH4-ioNH2 képletű vegyületet kapunk. [<x]58922= -33,3” (c=0,045, 10 % ecetsav), Rp=0,78 [ 1 -butanol/ecetsav/piridin/víz (15:3:10:12 tf)]. Az a-melanotropin, valamint nyíltláncú és gyűrűs analógjai biológiai hatását úgy határozzuk meg, hogy megmérjük, milyen mértékben képesek e vegyületek a béka bőrén és a gyík bőrén végzett in vitro kísérletekben a melanoszómák (melanint tartalmazó szemcsék) szétterjedését serkenteni. Ez az in vitro meghatározás egyértelmű dózis-hatásgörbéket ad a 2,5 x 10"11 mól és 4 x 10-10 mól koncentrációk közötti tartományban, és segítségével az a-melanotropinnak már igen kis, körülbelül 10-11 mólos koncentrációit is ki lehet mutatni. A meghatározás a melanoszómáknak a bőr melanofor (melanint tartalmazó) sejtjeinek nyúlványaiban lejátszódó, centrifugális irányú szétterjedésének (amelynek eredményeképpen a bőr sötétebb színű lesz) mérésén alapul. A vizsgálathoz használt valamennyi vizsgálati oldatot egy 104 mólos törzsoldat sorozathígításával készítjük el. A mérésekhez használt békák (Rans pipiens) a Kons Scientific, Germantown, WI cégtől, a gyíkok (Anolis carolinensis) a Snake Farm nevű cégtől (La Place, LA.) származnak. Az a-melanotropin gyűrűs analógjainak biológiai hatását az alábbi táblázatban adjuk meg: Analóg sorszáma Biológiai Béka hatás Gyík Maradék hatás Béka Gyík 16. 1,0 1,0 P (-) P H 17. 1,0 6,0 P (+) p (+) 18. 0,5 9,0 P (+) P (+) 19. 0,5 90,0 P (+) P (+) 20. 1.0 20,0 P (-) P (-) 21. 1,0 5,0 p (-) P (-) 22. 0,01 5,0 P (-) P (-) Korábbi, 4,457,864 és 4,485,039 számú amerikai szabadalmi leírásaink, amelyeket itt teljes egészükben idézünk, jelezték, milyen nagy jelentősége van annak, hogy az a-melanotropin vagy a adreno-kortikotróp hormon hatásért felelős helye rögzített konformációjú legyen. Ha az a-melanotropin peptidláncának 4-es és 10-es helyzetében levő metionint (4-es helyzet) és glicint (10-es helyzet) pszeudoizosztér helyettesítés útján ciszteinnel mint aminosavval helyettesítjük, akkor az így létrejövő, rögzített konformációjú gyűrűs szerkezet eredményeképpen e szintetikus analóg sokszorosára növeli a melanocitáknak a melaninszemcsék szétterjedését eredményező aktivitását. A gyűrűs analógoknak ezek nyíltláncú rokonaihoz képest sokkal nagyobb hatása nyilvánvalóan a biológiai értékméréshez használt rendszertől függ. Elsősorban olyan analógokat kívántunk előállítani, amelyek a gyík bőrén mérve erős hatást mutatnak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
