200479. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunimpressziós aktivitással rendelkező peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 200479 B 2 tesítését és a gyantáról való leválasztását 2 % anizolt tartalmazó HF-dal végezzük, 0 'C-on, 35 percen át. A HF-t vákuumban 0 *C-on távolítjuk el, a peptidet etiléterrel kicsapjuk, a gyantáról 30 %-os vizes ecetsavval extraháljuk és az oldatot liofilizáljuk. A peptidet sómentesítéssel tisztítjuk - 5 %-os vizes ecetsavban, egy 92 x 2,6 cm-es Sephadex G-15 oszlopon - és liofilizáljuk. A preparatív HPLC-t egy C18 Vydac 2118TP1010 oszlopon (250 x 10 mm) végezzük, 24 % acetonitrilt tartalmazó 0,1 %-os vizes trifluorecetsavval, 5 ml/perc sebességgel. A nagyobb csúcshoz tartozó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. TLC: Merck 5715 20 x 20 cm-es Silica gel 60 lemezek (vastagság 0,25 mm); n-butanol/ecetsav/víz/piridin 6:1,2:4,8:6 (TLC I) Rf=0,52 FAB-MS: (M+H)= 1879 ± 1 m.E. (számított: 1879,2). Aminosav-elemzés (6N HCl-lel végzett hidrolízis, 24 óra 106 *C- on): Asx 3,06 (3); Alá 0,99 (1); Leu 4,97 (5); Lys 2,01 (2); Arg 4,01 (4). Peptid-tartalom: 72 tömeg%. 2-4. példa Lényegében az 1. példa szerinti módon a kővetkező peptideket állítjuk elő: a példa peptid sorszáma 2. H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2 3. H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu-NH2 4. H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-GIy-Leu-Leu-OH A 2-4. példa szerint előállított peptidek a következő fizikai tulajdonságokkal rendelkeznek: a példa molekulasúly HPLC sorszáma elméleti FAB-MS(M+H) tr (perc), ± 1 mp 15-40%-os grádiens 2. 1695 1696 9,8 3. 1940 1940 17,6 4. 1295 1297 10,8 Az aminosav-elemzés eredményei a következők (6N HC1, 20 óra 106 "C-on): A példa sorszáma 2. 3. 4. Asx 2,01(2) 1,03(1) Thr 3,01(3) Glx 2,03(2) 2,05(2) Gly 1,07(1) 3,10(3) 1,05(1) Alá 2,05(2) Val 0,95(2) Leu 3,94(4) 6,06(6) 2,92(3) Phe 1,00(1) Lys 2,17(2) 0,99(1) Arg 2,20(3) 1,81(2) 2,00(2) 5. példa A H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2 BSA konjugátumának előállítása A peptidet BSA-val (szarvasmarha szérumalbumin) kapcsoljuk össze oly módon, hogy l-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-kart>odiimid-hidrokloriddal (EDAQ reagáltatjuk. 1 mM peptidet 1,84 ml vízben 15-30 percen át 0,16 ml (25 mg/ml töménységű oldat) MSA-val reagáltatjuk, amelyet előzetesen 1-30 percen át vízben 40 mg EDAC-val kezeltünk. Az akti vált BSA-mintát csepegtetve, kevertetés közben adagoljuk a peptid-oldathoz, majd 10 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 2,0 ml 1,0 M glicin oldatot adunk hozzá és az elegyet egy éjjelen át 4 *C-on forgómozgásban tartjuk. A fölösleges reagens és a nem-konjugált peptid eltávolítására a mintákat alaposan dializáljuk 4 'C-on, először 15x4 liter vízzel, majd 2x4 liter CELLGRO-val (a Mediatech szövettenyésztéshez használható táptalaja) szemben. A mintákat - közvetlenül a szövettenyészetekhez való hozzáadás előtt - 0,45 (im-es cellulózacetát membrán segítségével sterilre szüljük. A peptid-kapcsolás mértékét fordított fázisú HPLC-vel határozzuk meg. Az 1., 3. és 4. peptid BSA-konjugátumát úgy állítjuk elő, hogy először a peptidet az előbbiekben leírtak szerint EDAC-vel aktiváljuk, majd BSA-val reagáltatjuk. 6. példa A *H-timidin beépülésének gátlása különböző peptidekkel vegyes limfocita tenyészetekben Aszeptikusán eltávolított lépet RPMI 1640 tápközegben felaprítunk oly módon, hogy egysejtes szuszpenziót kapjunk. Az eritrocitákat úgy vetjük alá lízisnek, hogy a sejteket ACK pufferben (0,155 M NH4CI, 0,1 mM EDTA, 0,01 M KHCO3) szuszpendáljuk és a visszamaradó leukocitákat mossuk. C57BL/6 (5x10s sejt) és DBA/2 (5x 10s sejt) leukocitákat együtt tenyésztünk 0,1 ml RPMI-1640-ben, amelyhez 2 % borjúembrió-szérumot (FCS) adtunk, 96 helyes mikrotitráló lemezeken. A sejttenyésztés megindítására különböző koncentrációkban adagoljuk a peptideket. 120 órás inkubálás után (37 ”C) - ez magában foglal, a tenyésztés utolsó 18 órájában, egy 1 (iCi (3H)-TdR-rel való besugárzást is - a sejteket egy automatikus sejt-elkülönítő segítségével szűrőpapír-csíkokra választjuk ki és ÁCS szcintillációs folyadékban helyezzük el ezeket a csíkokat (Amersham, Oakville, Ontario). A (3H)TdR beépülés mértékét ezután Beckman LS 7800 fölyadékszcintillációs számlálóval mérjük. Vegyület Peptid13 |iM 3H-timidin beépülés, cpm Gátlás,% BSA kontroll3 0 6621 ± 442-0 8023 ± 444 — 3. példa 24 1328 ± 421 80 12 3417 ± 263 57 1. példa 18 1800 ± 412 73 9 3267 ± 457 59 2. példa 28 2209 ± 1471 67 14 4406 ± 848 45 4. példa 8 3063 ± 372 54 4 5751 ± 407 28 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
