200479. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunimpressziós aktivitással rendelkező peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 200479 B 2 A találmány szerinti peptidek immunszupresszív hatású anyagok és bármely olyan betegség vagy elváltozás kezelésére felhasználhatók, amelyekben kívánatos a humorális vagy a sejtek által közvetített immunitás elnyomás. Ilyen terület pl. a reumás izületi gyulladás kezelése, valamint a kilökődési reakció megelőzése vese, máj vagy szív átültetését követően. A találmány szerinti peptidek elsősorban azáltal fejtik ki immunszupresszív hatásukat, hogy képesek elnyomni a limfociták szaporodását. Az itt használt értelemben a „beteg” kifejezést az emlősökre, azaz az emberre és a főemlősökre vonatkoztatva használjuk, ideértve a juhokat, lovakat, szarvasmarhákat (teheneket és bikákat), sertéseket, malacokat, kutyákat, macskákat, patkányokat és az egereket. Bár a találmány szerinti peptidek közül néhány sértetlenül halad át a bélrendszeren, orális bevitel után, előnyben részesítjük a parenterális bevitelt, amely történhet pl. s.c., i.v., i.m. vagy i.p. úton, depó-injekciókkal vagy a készítmények beültetésével. Parenterális úton a vegyületek egység-dózisként vihetők be, egy olyan oldat vagy szuszpenziót injektálásával, amely a vegyületet egy fiziológiailag elfogadható hígítószerben tartalmazza egy gyógyászati szempontból megfelelő vivőanyaggal együtt, amely lehet egy steril folyadék, pl. víz vagy olajok, felületaktív anyagok és más, gyógyászati szempontból elfogadható hatásfokozók hozzáadásával, vagy ezek nélkül. Az ilyen készítmények előállításához használt olajokra jellegzetes példák a következők: állati, növényi eredetű vagy szintetikus olajok, pl. mogyoróolaj, szójaolaj és kőolaj. Folyékony vivőanyagként, különösen injektálható oldatok esetében, általában előnyben részesítjük a víz, sóoldat, vizes dextróz és hasonló cukor oldatok és glikolok, pl. propilénglikol vagy polietilénglikol alkalmazását. A vegyületek nyújtott hatású injekciók vagy beültetett készítmények alakjában is bevihetők, amelyek oly módon készíthetők ki, hogy lehetővé tegyék az aktív komponens időben elnyújtott felszabadulását. Az aktív komponens pelletekbe vagy kis hengerekké tömöríthető és s.c. vagy i.m. ültethető be, nyújtott hatású injekcióként vagy beültetett preparátumként. A beültetett készítmények előállításához közömbös anyagokat, így biológiai úton lebontható polimereket vagy szintetikus szilikonokat (amilyen pl. Dow-Corning Co. által előállított Silastic, egy szilikongumi) alkalmazhatunk. A találmány szerinti peptidek hatásának maximális kifejlesztésére, az embergyógyászatban, előnyösen egy makromolekuláris hordozót, pl. szérumalbumint, így humán szérumalbumint alkalmazhatunk. Más vivőanyag pl. a tengeri csiga (keyhole limpet) hemocianin vagy valamely szintetikus polimer, pl. a poli(D-Glu, D-Lys). A pepiidnek a hordozóhoz való kapcsolására többféle módszert alkalmazhatunk; amilyen pl. egy peptid Lys-en keresztül, glutáraldehid felhasználásával történő összekötés (Reichlin, Methods Enzymol. 70, 159-165, 1980) vagy a DCC módszer) 1. pl.: Atassi et al., Biochem. Biophys. Acta 670, 300-302, 1981), a DCC felhasználásával egy peptid-Asp-on vagy -Glu-on keresztül való kapcsolás (Bauminger et al., Methods Enzymol. 70, 151-159, 1980), egy peptid-Tyr-on keresztül való kapcsolás bisz(diazotált)-benzidin alkalmazásával (Walter et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77, 5197-5200, 1980), fotokémiai kapcsolódási helyeken keresztül való kapcsolás (Parker et al.. Cold Spring Harbor Symp. - Modem Approaches to Vaccines, Ed. Chanock & Lemer, Cold Spring Harbor Press, New York, 1983, sajtó alatt) vagy egy peptid-Cys-en keresztül való összekapcsolás (Liu et al., Biochem. 18, 690-697, 1979). A peptid-hordozó konjugátumokat dialízissel vagy gélszűréssel választjuk el a feleslegben visszamaradó szabad peptidektől. A vivőanyag peptid-terhelésének szintje vagy radioaktív nyomjelző alkalmazásával, egy különleges eljárás szerint) a komplexbe nem kötött ill. a komplexbe kötött peptid HPLC-meghatározásával), vagy a konjugátum kvantitatív aminosav-elemzésével végezhető el, amelyet a peptidet nem horodzó vivőanyag elemzésével párhuzamosan végzünk. Az utóbbi eljárás alkalmazásakor előnyösen egy nem-természetes, különleges aminosav építendő be a pepiidbe az N-terminális vagy a C-terminális oldalon (ilyen pl. a Nie), amely, a peptid-beépítés kvantitatív maikereként szolági a konjugátum aminosav-meghatározásakor. Ez az Nie tehát „köztartóként” funkcionálhat az immunszupresszív szerkezet és a kapcsolás elősegítésére bevitt esetleges aminosavak - pl. az előbbiekben leírtak szerint a Cys, Lys vagy Tyr - között. A találmány szerinti peptidek immunszupresszív anyagok és a limfociták szaporodásának gátlásával nyomják el a beteg limfocita rendszerének működését. Míg a találmány szerinti peptidek mind a T-, mind a B-sejtek szaporodását gátolják, egy konkrét peptid kitüntetetten vagy a T-, vagy a B-limfociták szaporodását függesztheti fel. Valamennyi, találmány szerinti peptid azonban elnyomja a T-limfociták szaporodását. A bevitt peptid mennyisége változhat a betegtől, a bevitel módjától, a betegség vagy elváltozás súlyosságától függően és bármely hatásos mennyiséggel azonos lehet. Kívánatos a peptidek ismételt naponkénti bevitele. A találmány szerinti peptidek immunszupresszió szempontjából hatásos mennyisége és a limfocita rendszer ill. a limfociták szaporodásához szükséges mennyiség kb. 0,001 mg/kg - kb. 10 mg/kg lehet, a beteg testtömegére vonatkoztatva. A peptidet előnyösen egység-adagolási alakban visszük be - napi 1-4 alkalommal -, pl. 10 mg-os dózisokban. Példák A találmányt a következőkben nem-korlátozó jellegű példákkal szemléltetjük. 1. példa A H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg— Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH2 előállítása A peptidet a szilárd-fázisú eljárások valamelyikével szintetizáljuk, 0,1 mmól gyanta felhasználásával (0,48 mmól/g p-metil-benzhidril-amin). A kettős szimmetrikus anhidridekkel való kapcsolást 2,0 mmól N3**®-Boc-aminosav (Peptides International) alkalmazásával végezzük. Az alkalmazott oldallánc-védelem a következő: Asp (Chx), Arg (Tos), Lys (2-CBZ). A szintézis befejezése után az N^-Boc védőcsoportot 50 %-os trifluorecetsav:metilénklorid elegy alkalmazásával távolítjuk el. A gyantát háromszor mossuk metilénkloriddal, semlegesítés céljából háromszor mossuk 10 % diizopropil-etilamint tartalmazó metilénkloriddal, majd háromszor mossuk metilénkloriddal és vákuumban szárítjuk. A peptid védócsoport-men-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
