200479. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunimpressziós aktivitással rendelkező peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
I HU 200479 B 2 Az alfa-amino-védett aminosavnak a hordozó gyantához való kapcsolását követően a védőcsoportot bármilyen megfelelő eljárás alkalmazásával - metilénkloridban oldott trifluor-ecetsavas, trifluorecetsavas vagy dioxánban oldott sósavas kezeléssel - eltávo- 1 ttjuk. A védőcsoport eltávolítását 0 *C és a szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. Alkalmazhatunk más, szokásos lehasító reagenseket és körülményeket is a specifikus alfa-amino-védőcsoportok eltávolítására. Az alfa-amino-védőcsoport eltávolítása után a többi védett aminosavat szakaszosan, a kívánt sorrendben kapcsoljuk. Egy másik megoldás szerint a gyanta-hordozón rögzített aminosav-szekvenciával való kapcsolás előtt kapcsolható össze több aminosav-csoport, az „oldatos módszerrel”. A polipeptid szekvenciába bevitt egyes aminosavak esetében alkalmazott alfa-amino-védőcsoport bármilyen, a szakember számára ismert védőcsoport lehet A számbavehető alfa-amino-védőcsoportok közé tartoznak a következő típusokba sorolható vegyületek: (1) acil-típusú védőcsoportok, pl. formil-, trifluor-acetil-, ftalil-, toluol-szulfonil- (tozil-), benzol-szulfonil-, nitro-fenil-szulfonil-, tritil-szulfenil-, o-nitro-fenoxi-acetil- és gamma-klór-butiril-csoport; (2) aromás uretán típusú védőcsoportok, pl. a következők: benziloxikarbonil- és helyettesített benziloxikarbonil-csoport, így p-klór-benziloxikarbonil-, p-nitro-benziloxikarbonil-, p-bróm-benziloxikarbonil-, p-metoxi-benziloxikarbonil-, 1 -(p- bifenil)-1 -metil-etoxikarbonil-alfa,alfa-dimetil-3,5-dimetoxi-benziloxikar bonil- és benzihidriloxikarbonil-csoport; (3) alifás uretán védőcsoportok, pl. a terc.butiloxikarbonil-(Boc), diizopropil-metoxikarbonil-, izopropiloxikarbonil-, etoxikarbonil- és alliloxikarbonil-csoport; (4) cikloalkil-uretán típusú védőcsoportok, pl. ciklopentiloxikarbonil-, adamantiloxikarbonil- és ciklohexiloxikarbonil-csoport; (5) tiouretán típusú védőcsoportok, pl. fenil-tiokarbonil-csoport; (6) alkil-típusú védőcsoportok, pl. trifenil-metil (tritil-) és benzil-csoport; (7) trialkil-szilán-csoportok, pl. trimetil-szilán csoport. A kitüntetett alfa-amino-védőcsoport a terc.butiloxikarbonil-csoport A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása a szakember tudásához tartozik. Különösen megfelelő kapcsoló szer abban az esetben, ha Gin, Asp vagy Arg a hozzáadni kívánt aminosav, az N,N’- diiziopropil-karbodiimid és az 1-hidroxi-benzotriazol. Ezeknek a reagenseknek az alkalmazása megakadályozza a nitril- és a laktám-képződést. Más kapcsolószerek pl. a következők: (1) karbodiimidek (pl. az N,N’-diciklohexiI-karbodiimid és az N- etil-N’-(gamma-dimetil-amino-propil-karbodiimid); (2) a ciánamidok (pl. az N,N-dibenzil-ciánamid); (3) a ketán-iminek; (4) az izoxazólium-sók (pl. az N-etil-5-fenil-izoxazólium-3’-szulfonát); (5) az aromás jellegi!, a gyűrűben 1-4 nitrogénatomot tartalmazó monociklusos amidok, pl. a imidazolidok, pirazolidok és az 1,2,4- triazolidok. A felhasználható jellegzetes heterociklusos aminok közé tartozik az N,N’-karbonil-diimidazol és a N,N’-karbonil-di-1,2,4-triazol; (6) az alkoxilezett acetilének (pl. az etoxi-acetilén); (7) azok a reagensek, amelyek az aminosav karboxil-csoportjával vegyes anhidridet képeznek, (pl. a klórhangysav-etilészter és a klórhangyasav-izobutilészter); vagy a kapcsolandó aminosav szimmetrikus anhidridje (pl. Boc-Arg-O-Arg-Boc); és (8) az egyik gyűrű-nitrogénatomon hidroxicsoportot hordozó, nitrogén-tartalmú heterociklusos vegyületek (pL az N-hidroxi-ftálimid, N-hidroxi-szukcinimid és az 1-hidroxi-benzotriazol). További aktiváló reagenseket és ezeknek a peptid-kapcsolás területén való felhasználását Kapoor (J. Pharm. Sei. 59, p. 1-27., 1970) írja le. Előnyben részesítjük kapcsoló reagensként a szimmetrikus anhidrid alkalmazását. Mindegyik védett aminosavat vagy aminosav-szekvenciát kb. négyszeres feleslegben visszük be a szilárd fázisú reaktorba és a kapcsolást 1:1 dimetilformamid:metilénklorid elegyben vagy dimetil-formamidban vagy előnyösen metilénkloridban hajtjuk végre. Azokban az esetekben, amikor nem teljes kapcsolás megy végbe, a kapcsolási eljárást megismételjük az alfa-amino-védőcsoport eltávolítása előtt, a következő aminosav kapcsolását megelőzően, a szilárd fázisú reaktorban. A kapcsolási reakció sikerét a szintézis mindegyik fázisában nyomon követjük, az E. Kaiser et al. (Anal. Biochem. 34,595,1970) által leírt ninhidrin reakcióval. Miután a keresett aminosav-szekvenciát kialakítottuk, a peptidet eltávolítjuk a gyantáról. Ez hidrolízissel történhet, pl. oly módon, hogy a gyantához kötött polipeptidet dimetil-szulfid, p-krezol és tiokrezol híg vizes hidrgénfluoridos oldatával kezeljük. Mint ez a szilárd fázisú peptid-szintézis területén jártas szakember számára ismert, sok aminosav hordoz olyan funkciós csoportokat, amelyek védelmet igényelnek a lánc előállítása során. A megfelelő védőcsoport felhasználása és kiválasztása a szakember tudásához tartozik; függ attól, hogy milyen aminosavat kell megvédeni és hogy jelen vannak-e más védett aminosavmaradékok a pepiidben. Az ilyen oldallánc-védőcsoport kiválasztása kritikus olyan vonatkozásban, hogy ennek olyannak kell lennie, hogy ne legyen eltávolítható hasítással az alfa-amino-csoport védőcsoportjának lehasítása során. A lizin esetében pl. megfelelő láncvédő csoport a benziloxikarbonil- és a helyettesített benziloxikarbonil-csoport, mimellett ez a helyettesítő a következő csoportok valamelyike lehet:- halogénatom (pl. klór-, bróm- vagy fluoratom);- nitro-csoport (pl. tehát 2-klór-benziloxikarbonil-, 3,4-diklórbenziloxikarbonil-, p-nitro-benziloxikarbonil-csoport);- tozilcsoport; - terc.amiloxikarbonil-, terc.butiloxikarbonil- és diizopropil-metoxikarbonil-csoport. A treonin és a szerin alkoholos hidroxiesoportja acetil-, benzoil-, terc.butil-, tritil-, benzil-, 2,6-diklór-benzil- vagy benziloxikarbonil-csoporttal védhető. A kitüntetett védőcsoport a benzil. Ezek a csoportok a szakember számára jól ismert módszerekkel távolíthatók el. A védőcsoport eltávolítását általános esetben azt követően hajtjuk végre, hogy a peptidlánc szintézise befejeződött, de a védőcsoportok bármely megfelelő időpontban eltávolíthatók. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
