200438. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metionin-szulfoxid-csoportot tartalmazó peptidek és fehérjék redukálására
3 HU 200438 B 4 Ennélfogva a találmány egy olyan eljárás kidolgozására irányul, amely az egy vagy több metionínszulfoxid-csoportot tartalmazó peptidek és fehérjék kezelésére szolgál, abból a célból, hogy az ezekben előforduló metioninszulfoxid-csoportokat metionin-csoportokká redukálja. A találmány szerinti eljárás magába foglalja az említett peptidnek vagy fehérjének egy lényegében vízmentes trifluor-ecetsavas közegben 0,01m-3m di-(l-3 szénatomos alkilj-szulfiddal és 0,01m-3m. Haloidsavakként sósavval, brómhidrogénsawal vagy jódhidrogénsavval történó reagáltatását. Az előzőekben említettük, hogy találmányunk célja a metioninszulfoxid-csoportokat tartalmazó fehérjék és peptidek szelektív, a megfelelő metionin csoportokká történő redukciójára szolgáló eljárás kidolgozása. Az eljárás fő alkalmazása biológiailag aktiv késztermék előállítása az oxidált állapotú prekurzor-vegyületből, mely utóbbi többnyire a fehérje, illetve a peptid szintetikus előállításánál alkalmazott körülmények következtében keletkezik. A metionin csoportok szulfoxiddá történő oxidációjához vezető reakciókörülmények a feldolgozási lépések bármelyikénél felléphetnek, beleértve a kívánt peptid vagy fehérje szintetikus előállításának és tisztításának reakciólépéseit. Amennyiben a metionin csoportok redukált állapotának viszszaállitására a gyakorlatban használható módszer nem áll rendelkezésre, akkor nehézségek támadnak a kívánt termék ipari mértékű előállítása során, legalábbis ha a biológiailag aktív végtermék nagyüzemi előállításáról van szó. A találmány szerinti eljárást trifluor-ecetsavban, mint oldószerben hajtjuk végre. Noha nem abszolúte alapvető feltétel, igen ajánlatos a találmány szerinti eljárást lényegében vízmentes körülmények között végezni, és Így vízmentes trifluor-ecetsavat felhasználni. A .lényegében vízmentes' trifluor-ecetsav kifejezés nem azt jelenti, hogy az eljárás kivitelezése során intézkedéseket kellene foganatosítani a víznyomók jelenlétének kizárása érdekében. Csak a viz direkt hozzáadásának elkerülését kell biztosítani. A trifluor-ecetsavhoz a peptidet, valamint egy szerves szulfidvegyületet adunk hozzá. A reagensek hozzáadásának sorrendje tetszőleges. Ideálisnak mégis azt az - esetet tekinthetjük, ha először a fehérjét vagy a peptidet oldjuk fel a trifluor-ecetsavban, azután a szulfidvegyületet, majd a savat adagoljuk a reakcióelegybe. A trifluor-ecetsavba adagolt fehérje vagy peptid mennyiségét általában úgy választjuk meg, hogy annak koncentrációja mintegy 0,01-100 mg/ml legyen. A fehérjeilletve peptidkoncentráció célszerűen 0,1- -20 mg/ml között, még előnyösebben 1- -10 mg/ml között van. Igen előnyösen alkalmazható a találmány szerinti eljárásban a dimetil-szulfid. A szerves szulfidot olyan mennyiségben adjuk a reakcióelegyhez, hogy annak koncentrációja általában mintegy 0,01m-3m közötti értéket érjen el. A szulfid koncentrációja előnyösen mintegy 0,lm-lm közötti és még célszerűbben 0,5m-lm között van. A másik lényeges reagens a sósav, a hidrogén-bromid vagy a hidrogén-jodid, választjuk ki. Haloidsavként előnyös a sósav alkalmazása. A sav általában mintegy 0,0 lm-3m közötti koncentrációban van jelen a reakcióelegyben. Előnyösen a haloidsav koncentrációja mintegy 0,01m-lm között van. Az említett koncentrációtartományon belül célszerű a reakciót a koncentrációtartomány alsó vége táján folytatni, amennyiben a kezelendő fehérje vagy peptid egy vagy több diszulfidkötést tartalmaz, míg a tartomány felBŐ részén akkor célszerű dolgozni, ha diszulfidkőtós nincs a molekulában. .Anélkül, hogy a reakció célszerűen vízmentes körülmények között történő lejátszatására vonatkozólag korábban mondottakkal szembehelyezkednénk, tény az, hogy bizonyos mennyiségű víz normális körülmények között a haloidsav hozzáadása révén bekerül a reakciórendszerbe. Mivel a haloidsav felhasznált összmennyisége csekély, és koncentrált sav hozzáadásával is megoldható a bejuttatása a rendszerbe, ezért ténylegesen csak egy kismennyiségű viz juthat be a reakcióelegybe. Ez a mennyiség alapvetően nem okoz problémát a találmány szerinti eljárás kivitelezésénél. A találmány szerinti eljárás széles hőfoktartományban, például mintegy 4 °C és mintegy 45 °C között általában bármely hőmérsékleten kivitelezhető. Előnyösen a reakciót szobahőmérséklet környékén (mintegy 20 °C-25 °C-on) hajtjuk végre. Normális körülmények között a redukció meglehetősen gyorsan lejátszódik. Annak ellenére, hogy a reakciót egy hosszabb időtartam, például 6 óra alatt is elvégezhetjük, mindazonáltal teljes lejátszódásához 5 perc is elegendő lehet. Ezért rendszerint a reakció kivitelezésére egy mintegy 30 perc és 90 perc közötti időtartamot választunk. A redukció befejeződése után a kívánt termék kinyerését az e célra megfelelőnek ismert technikák széles köréből alkalmasan választott módszerrel végezhetjük. Az alábbi példák a találmány szerinti eljárás illusztrálására szolgálnak. A példák ismertetésének nem célja azonban a találmány oltalmi körének ezekre korlátozása. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
