200438. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metionin-szulfoxid-csoportot tartalmazó peptidek és fehérjék redukálására
5 HU 200438 B 6 1. példa H-Phe-Met( 0)-Cly-Pro-Gl u-Th r-NHi (FM(O)GPET-NIh) kezelése 2,15 mg FM(0)GPET-NH2 peptidet 1,72 ml vízmentes trifluor-ecetsavban feloldunk. A peptidoldatot tizenhét egyenként 80 jul-es alikvotra osztjuk. Egy alikvotba, amely kontrollként szolgál, nem teszünk sem dimetil-szulfidot, sem sósavat. A tóbbi tizenhat peptidoldatba különbőzé mennyiségű dimetil-szulfidot adagolunk, amelynek a koncentrációja Így 0,01M és 1M között van, valamint cc. sósavat úgy, hogy annak a koncentrációja 0,01N és IN között legyen. Az oldatokat kezdetben erőteljesen keverjük, majd szobahőmérsékleten 60 percen keresztül állni hagyjuk őket. A reakció leállítását 900 pl 0,1%-os vizes trifluorecetsav-oldattal végezzük. A végbement kémiai reakció mértékét nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával határozzuk meg, fordított fázisú (0,46 z x 25 cm-es) Altex Ultrasphere ODS oszlopot 5 használva. A kromatográfiás analízist 45 °C-on, 0,1%-os vizes trifluorecetsav-oldattal hajtjuk végre, az eluáláshoz lineárisan növekvő acetonitril-grádienst alkalmazva. A mennyiségi meghatározást a 214 nm-nél mért 10 abszorbciós csúcsok területének mérése alapján végezzük. A trifluor-ecetsav(dimetil-szulfid)sósav eleggyel kezelt FM(0)GPET-NH2 egy olyan peptidet eredményezett, amely a szintetikus úton előállított, standard FMGPET- 15 -NH2-vel megegyező kromatográfiás retenciós időt mutatott. A vizsgálat eredményeit az alábbi 1. táblázaton mutatjuk be. 20 1. táblázat FM(0)GPET-NH2 redukciója HC1 koncentráció n DMS koncentráció m1 Képződött FMGPET-NH2 % Maradék FM(0)GPET-NH2 % 0 0 0 100 0 0,01 . 0 98 0 0,1 0 95 0 1,0 3 89 0,01 0 4 95 0,01 0,01 10 86 0,01 0,1 11 84 0,01 1,0 12 85 0,1 0 4 96 0,1 0,01 57 41 0,1 0,1 54 41 0,1 1,0 68 33 1,0 0 4 85 1,0 0,01 94 0 1,0 0,1 93 0 1,0 1,0 95 0 1 vízmentes trifluor-ecetsavban 2. példa GRF(l-45)Met(OP!J tLyd^-OH kezelése 1,68 mg GRFd-áSlMeKOF.LysW-OH-t 1,5 ml vízmentes trifluor-ecetsavban feloldunk. A peptidoldat 900 pl-éhez 100 pl dimetil-szulfidot adunk, majd 10 jul koncentrált sósavat. Az oldatot erőteljesen keverjük, azután szobahőmérsékleten, keverés nélkül állni hagyjuk. 5, 15, 30 és 60 perccel a sósav hozzáadása után a reakcióelegybői 60 pl-es alikvot mintákat veszünk. Minden egyes mintát nitrogénáramban megszáritunk, és 0,1%-ob vizes trifluorecetsav-oldat hozzáadásával 1,2 ml térfogatra felhígítunk. A 60 perces reakcióidő végén további 7,6 pl tömény sósavat adunk a 760 pl visszamaradt peptidoldathoz. Az oldatot ismét erőteljesen megkeverjük, majd szobahőmérsékleten állni hagyjuk, keverés nélkül. 65, 75, 90, 120 és 180 perccel az első sósavhozzáadás után 60 pl-es alikvot mintákat veszünk, amelyeket nitrogónáramban megszáritunk és 0,1%-os vizes trifluorecetsav-oldattal a fent leirt módon felhígítunk. A kémiai módosítás mértékét nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC), 0,46 x 10 cm-es Vydac C4 fordított fázisú oszloppal határozzuk meg. A kromatográfiás 5
