200438. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metionin-szulfoxid-csoportot tartalmazó peptidek és fehérjék redukálására
1 HU 200438 B 2 A találmány tárgya új eljárás metionin-szulfoxid-cso portot tartalmazó peptidek és fehérjék redukálására. A metionin oxidációs származéka, a metionin-szulfoxid a természetben és a peptidkémiai szintézisek során egyaránt gyakran előforduló termék. Könnyen képződik, s ez a természetes forrásokból elkülönített metionintartalmú peptidek legtöbbjénél közönségesen előforduló szennyeződéssé avatja. Tisztított peptidek esetében kiváltképpen ajánlatos, hogy elkerüljük az olyan tárolási körülményeket, amelyek a szulfoxidképződésnek kedveznek [Toennies, G., and Callan, T.P. J.Biol.Chem. 129, 481 (1939)]. Ha egyszer már oxidálódott, az eredeti molekula tioétercsoportjának nukleofil hajlama az aminosavat a további módosítások iránt érzéketlenebbé teszi. Ez képezi a peptidszintézisben [Iselin, B. Helv. Chim. Aqta 44, 61, (1961)] és a fehérjemódosltási vizsgálatokban [Tashjian, A., Ontjes, D., and Munson, P.L. Biochem. 3, 1175 (1964)] való felhasználásának alapját. A metioninnak az a hajlama, hogy mihelyt tisztított állapotban van, oxidálódjék, hozzávéve a reverzibilis védelem követelményét a szintézisek során, számos kutatót arra indított, hogy a metionint más aminosavakkal helyettesítsék [Kempe, T., Chow, F., Peterson, S.M., Baker, P., Hays, W., Opperman, G., L’Italien, J.J., Long, G., and Paulson, B. Biotechnology 4, 565 (1986); Krstenansky, J.L., Trivedi, D., Johnson, D., and Hruby, V. J.Ara. Chem. Soc. 108, 1696 (1986), és Schalch, D., Reisman, D., Emler, C., Humbel, R., Li, C. H., Peters, M., and Lau, E. Endrocrinology 115, 2490 (1984)]. A metionin-szulfoxidot tartalmazó peptidek szelektív és a molekula lebomlását elő nem idéző redukciójának kérdése a peptidkémia visszatérő problémája [Kessler, W., and Iselin, B. Helv. Chim. Acta 49, 1330 (1966)]. A redukciót leggyakrabban a redukálószer magas koncentrációiban való alkalmazásával, magasabb hőmérsékleten érik el, redukálószerekként például ditio-treitolt vagy ß-merkapto-etanolt alkalmazva [Houghten, R.A., and Li, C.H. Anal. Biochem. 98, 36, (1979)]. A reakciósebesség ilyenkor kicsi és az eljárás rendszerint tökéletlen redukciót eredményez. Alternativ eljárásként más szerzők a dimetil-szulfiddal vagy tioanizollal végzett redukciót javasolják, amely az oxigénkicserélődésnek az előmozdításából áll, vizes-sósavas közegben [Savige, W.E. and Fontana, A. Adv. in Enzymology 47, (1977), 453; Shechter, Y. (1986) J.Biol.Chem. 261, 66 (1986)], vízmentes hidrogén-fluoridban [Tam, J.P., Heath, W.F., and Merrifield, R.B. J.Am. Chem.Soc. 105, 6442 (1983)], 1M trifluor-metán-szulfonsav/trifluor-ecetsavban [Fujii, N., Kuno, S., Otaka, A., Funakoshi, S., Takagi, K., and Yajami, H. Chem.Pharm.Bull., Jpn. 33, 4587 (1985)]. Ezekben az esetekben a redukció könnyen megy végbe, és a diszulfidhidak épsége változó mértékben marad meg. Mindamellett jelentékeny probléma adódik az ilyenfajta erős savakkal váló kölcsönhatás másodlagos következményei miatt. Bizonyos ideje ismeretes, hogy a haloidsavak katalizálják az oxigénatomnak a Bzulfoxid csoportról a szulfidcsoportra történő átvitelét [Scorrano, G. Acc.Chem. Rés, 6, 132 (1973)], Savige és Fontana, (lásd fent), elsőként Írták le világosan a szabad (tehát fehérjemolekula részét nem képező) metionin-szulfoxid redukciójának folyamatát 12n HC1 és dimetil-szulfid alkalmazásával. B módszer sikeres alkalmazását egy oxidált lizozimszármazék esetében, a másodlagosan fellépő mellékreakciók minimális mértéke mellett szintén leírták. Emlitett szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy .a reakciókörülmények meglehetősen szigorú feltételek által megszabottak és a sósav magas koncentrációja meg.kívánt'. Legújabban Shechter, (lásd fent) számolt be fehérjékben található metionin-szulfoxid hasonlóképpen végzett redukciójáról, dimetil-szulfid és változó koncentrációjú sósav felhasználásával. Következtetései szerint .4,4-10,7 m HC1 sósavkoncentráció mellett a reakció teljesen végbemegy, ugyanakkor alacsonyabb (azaz 1,0 m) sósavkoncentrációk esetén a redukciófok nagymértékű visszatartást szenved'. A másodlagosan fellépő módosító reakciók HPLC-analitikai módszerekkel történt megfigyeléséről egyik tanulmány sem számól be. A metionin-szulfoxidnak vízmentes hidrogén-fluoridban vagy lm trifluor-metán-szulfonsav/trifluor-ecetsavban végbemenő redukcióját a vizes sósavoldatban végbemenő analóg reakcióétól eltérő mechanizmusának tartják. Ilyen reakciókat ismertet a Tetrahedron Letters 23, (29) 2939 (1982) cikke és a Pept. Str. Funct Proc. Am. Pept. Symp. 8th, 83. old. összefoglalója. Feltételezések szerint ezekben az erős, vízmentes savakban a redukció a keverék aciditásának függvénye, és nem függ a savanion nukleofilitáaának -mértékétől. A közlemények hatékony redukcióról számolnak be a nemkívánatos módosítások minimális szintje mellett. Mindazonáltal, ezeknek az oldószereknek a maró természete különleges kezelési elővigyázatosságot igényel, ami használatuk elé komoly korlátokat állít. A találmány célja egy olyan könnyen kivitelezhető és nagymértékben szelektív fehérjekezelési eljárás kidolgozása, amely a fehérjékben éB a peptidekben előforduló metioninszulfoxid-csoportoknak metionincsoportokká történő Bzelektiv redukálását lehetővé teszi. A találmány szerinti eljárás segítségével konkrétan olyan reakciókörülmények között hajtható végre az említett redukció, amelyek lényegesen enyhébbek, mint azok, amelyeket a technika állásához tartozó korábbi eljárásokban alkalmaztak. 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
