200423. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a sebgyógyulást gyorsító, IGF-II-t tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
15 'HU 200423 B 16 példa A)/2) pontjában leírtak szerint eljárva előállított, 0,63 kb nagyságú, trpLEl-et és IGF-II-t kódoló EcoRI-BamHI fragmens 4 jul-ét elegyítjük, majd ligáljuk, lényegében a 4. példa A) pontja szerint eljárva. A ligáit DNS alkotja a kívánt pCZ21 plazmidot. B) A transzformáció és az Escherichia coli RV308/pCZ21 törzs vizsgálata 1) A transzformáció Egy -70 °C hőmérsékleten tárolt, E. coli K12 RV308 kompetens sejteket tartalmazó csövet felmelegitünk, és annak tartalmát az 5. példa A)/3) pontjában leírtak szerint eljárva előállított, .ligáit DNS-sel összekeverjük. A sejt-DNS keveréket jégfürdőben 1 órán át inkubáljuk. Ezután a sejteket összegyűjtjük, a felülúszót elóntjük, és a sejtüledéket 0,5 ml TY táptalajban felszuszpendáljuk. 30 perces, 25 °C hőmérsékleten végzett inkubációt kővetően a sejteket 50 /ag/ml kanamicinnel kiegészített TY táptalaj-lemezekre szélesztjük. A táptalaj-lemezeket 25 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. 2) A transzformánsok vizsgálata Minthogy a pCZ21 plazmid teljes DNS-szekvenciája megjósolható, a transzformált E. coli sejtekből izolált plazmid-DNS-t különböző restrikciós enzimekkel hasítjuk, hogy elektroforézissel és a gél elemzésével meghatározzuk, hogy a reakciótermékek azonosak-e a p(^Z21 plazmid hasítása esetén várhatóakkal. 6. példa A rekombináns emberi IGF-II tisztítása és jellemzése Az IGF-II tisztítási eljárása azoknak a zárványtesteknek a hővel elölt E. coli sejtekből való izolálásával kezdődik, amelyeket a hővel indukálható, úgynevezett runaway replikont tartalmazó pCZ21 plazmid segítségével kifejeztetett, LEl-Met-IGF-II fúziós fehérjetermék képez. A tisztítási eljárás a továbbiakban hasonlít az E. coli sejtekben kifejezett inzulin A és B láncok, valamint a proinzulin tisztítására használt eljáráshoz, amennyiben a kiméra-fehérje összetevőit hasítással felszabadítjuk, és a kívánt terméket S-szulfonáttá alakítjuk. Az S-szulfonát-vegyületet természetes konformációjú vegyületté ' alakítjuk át, majd azt tovább tisztítjuk. Az IGF-II tisztítási eljárása az LEl-Met-IGF-II fúziós fehérjetermékből indul ki; ez a termék a trpLE’ fehérje egy rövidített változatát tartalmazza. Azért használjuk a fenti IGF-II kimérát, mert a kisméretű (45 aminosav) LEI fehérje segítségével a kívánt termék nagy 10 mennyiségben keletkezik. Az IGF-II 6 cisztein-maradékának S-szulfonát-származékká való alakításával nagyszámú negatív töltést viszünk a molekulába: ez lehetővé teszi, hogy a fehérjét kényelmesen tisztíthassuk anioncserélő oszlopon. Az LEI fehérje nem tartalmaz ciszteint, így nem alakulhat S-szulfonát-származékká a szulfonálási reakcióban. Az LEI nem kötődik az anioncserélő oszlophoz, mivel pH = 7-en netto pozitív töltéssel rendelkezik. Az LEl-Met-IGF-II kiméra-fehérjét tartalmazó, hővel elölt E. coli sejteket 50 mmól Tris-HCl, pH = 8 oldatban felszuszpendáljuk (10 ml puffert számítva a nedves sejtmassza minden g-jára), majd 0,4 mg/ml (végkoncentráció) lizozim és 5 mmól (végkoncentráció) dinátrium-etilén-diamino-tetraecetsav hozzáadásával lizáljuk. Az elegyet 20 percen át szobahőmérsékleten keverjük, majd 20 percen át jógfürdőben hűtjük. Az erősen viszkózus szuszpenziót 0 °C hőmérsékleten ultrahanggal kezeljük (3 szakaszban, egyenként 30 másodpercen át), mig a sejtek teljes mértékben lizálnak. A szuszpenziót 4 °C hőmérsékleten, 20 percen át 3 000 g-n centrifugálva elválasztjuk a sejttörmeléket, valamint az oldható fehérjéket az LEl-Met-IGF-II kimérát tartalmazó zárványtestektől. A zárványtest-üledéket előbb 1 mólos nátrium-klorid-oldattal, majd 1 mólos urea-oldattal, végül pedig vízzel mossuk. Fehérje-vizsgálatot, valamint gél-elektroforézist végzünk a zárványtest-preparátumból kiindulva. A kiméra-fehérjéből bróm-cianidos hasítással szabadítjuk fel az LEI és az IGF-II fehérje-komponenseket, A zárványtesteket vízben felszuszpendáljuk (1 ml vizet számítva az eredeti sejtmassza 10 g-jára), majd 75% végkoncentrációban hangyasavat adagolva feloldjuk a kiméra-fehérjét. Az oldathoz 2 mmól végkoncentrációban nátrium-tioszulfátot és 200 mmól végkoncentrációban bróm-cianidot adagolunk. A szilárd bróm-cianid hozzáadásét vegyszerfülkében végezzük. A reakciót egy éjszakán át folytatjuk, és a hasítás mértékét nátrium-lauril- szulfát- poliakril-amid gél-elektroforézissel (PAGE) követjük. A reakcióelegyet vegyszerfülkében, forgó bepárlóban beszáritjuk. A kondenzátumot 5,25 (súly)% nátrium-hipokloritot tartalmazó fehérítő oldatba öntjük, hogy aztán elönthessük. A száraz fehér jefilmet azonos térfogatú vízben vesszük fel, majd fagyasztva szárítjuk. Az IGF-II-t 7 mól ureát és 500 mmól 8,2-es pH-jú Tris-bázist tartalmazó 5-10 mg/ml összfehérje-koncentrációjú oldatban 100 mmól nátríum-szulfittal és 10 mmól nátrium-tetrationáttal alakítjuk S-szulfonát-származékká. A reakcióelegy pH-ját szilárd Tris-bázis adagolásával állandó értéken tartjuk. A szulfonálási reakció követésére, és az S-szulfonát végtermék tisztítására LCC 500 FPLCTM (gyors fehérje-folyadék-kromatográ-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
