200423. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a sebgyógyulást gyorsító, IGF-II-t tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
17 HU 200423 B 18 fiás-) rendszerhez csatlakoztatott Pharmacia Mono QTManalitikai anioncseréló oszlopot használunk. A reakcióelegyet az oszlopra injektáljuk, és az oszlopot 7 mólos ureában oldott, 20 mmól koncentrációjú, 7,7-es pH-jú Tris-oldattal mossuk. Az FPLCTM rendszerrel nátrium-klorid gradienst állítunk elő: 20 mmól, 7,7-es pH-jú Tris-t és 7 mól ureát tartalmazó oldatban 20 perc alatt, 0 móltól 0,5 mólig növeljük a nátrium-klorid koncentrációját. Az el nem reagált anyag 120 mmól nátrium-klorid koncentrációnál^ eluálódik, mig az IGF-II (SS03')6 elúciójához 280 mmól nátrium-klorid-koncentráció szükséges. Az összegyűjtött anyag körülbelül 80%-ának molekulatömege 7500, ennek fele nem-redukáló körülmények között, nátrium-lauril-szulfát jelenlétében végzett poliakril-amid-gél-elektroforézis során, ahol az S-szulfonát-származék nagyobb látszólagos molekulatömeggel fut, IGF-II(SS03')6-nak bizonyul. A szulfonálási reakcióelegyet 50 mmólos ammónium-bikromát-oldattal szemben dializáljuk, majd fagyasztva szárítjuk. Az Így nyert nyersterméket IGF-II előállítására használjuk, hasonlóan járva el, .mint ahogy azt a 4 430 266 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom a proinzulin előállítása esetében leírja. 20 mmólos, 10-es pH-jú glicin-oldatban 67 jug/ml koncentrációbkn oldott IGF-II (SS03")6-hoz 4 °C hőmérsékleten, a cisztein-S-szulfonát-csoportokhoz képest kétszeres feleslegben adva ciszteint, diszulfid-kicserélődési reakciót végzünk. A reakció csillapítása .érdekében jégecetet adagolunk 1 mól ecetsav-végkoncentráció eléréséig. A reakció kinetikáját úgy követjük, hogy különböző időpontokban mintát veszünk a reakcióelegyből, jégecettel leállítjuk a reakciót, és mérjük a keletkezett natív IGF-II mennyiségét. A reakció 10-16 órán belül válik teljessé. A natív IGF-II-t nagynyomású folyadék-kromatográfiával, Zorbax C-8 150 A (DuPont) pórusméretű, 21,2 mm x 25 cm méretű preparativ oszlopon, szobahőmérsékleten tisztítjuk. 4 ml/perc átfolyási sebességgel egy .A" és ,B‘ oldószer elegyéból álló acetonitril-gradienst vezetünk az oszlopra; a gradiensben a ,B" oldószer koncentrációját 50X-ról 60X-ra növeljük 1 óra alatt. Az .A" oldószer összetétele: 0,2 mól diammónium-szulfát, 0,1 mól kénsav és 10X acetonitril, mig a .B ‘ oldószeré: 0,2 mól diammónium-szufát, 0,1 mól kénsav és 40X acetonitril. A natív IGF-II kimutatására ugyanezt az oldószer-rendszert, valamint fordított fázisú töltetet használunk 40 °C hőmérsékleten, 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel, 65X .B* oldószert tartalmazó eluenst. izokratikusan vezetve egy analitikai oszlopra (4,6 mm x x 25 cm). A maradék kis, illetve nagy molekulatömegű szennyeződéseket a továbbiakban 1 mólos esetsav-oldattal ekvilibrált Bio-Gel P—10 (BioRad) oszlopon végzett oldószer-cserével távolltjuk el. Az erről az oszlopról nyert IGF-II» csúcs nátrium-lauril-szulfát jelenlétében végzett poliakril-amid-gél-elektroforézis tanúsága szerint homogén, aminosav-összetétele pontosan a megfelelő, valamint a kompetitiv fehérjemegkótési vizsgálat (CPBA) során teljes mértékben aktív, összehasonlítva a patkányból származó IGF-II és az emberi IGF-II kötési görbéit, radioaktívan jelzett patkány IGF-II-t használva. Az emberi IGF-II kissé aktívabbnak tűnik a kompetitiv fehérje-megkötési vizsgálatban, mint a patkány IGF-II. 7. példa Az IGF-II ■ kiszerelése Egy tipikus helyi IGF-II kezelésre alkalmas gélkészítmény összetétele a következő: SúlyX steril desztillált víz 92,38 nátrium-dihidrogén-foszfát 0,03 CarbapolTM 0,5 glicerin 1.6 m-krezol 0,25 nátrium-hidroxid-oldat (IN) 0,5. A fenti elegy 6 ml-éhez 3 mg IGF-II-t adunk. 8. példa Az IGF-II sebgyógyltó hatásának vizsgálata A) Az IGF-II hatása a sebészeti■ úton létrehozott, teljes mélységű, 4 cm2 felületű bársebek záródására Ivarérett Fischer-344 hím patkányokat használunk kísérleti állatokként. A sebek előállítása érdekében végzett valamennyi sebészeti beavatkozásnál altatószerként étert használunk. Minden patkány háti részén egyetlen, 4 cm2 felületű, teljés mértékű bőrsebet -ejtünk. A sebet sebészeti ollóval, a bőr kivágásával készítjük. A sebzést követően Telfa pólyát helyezünk a sebre, és ragasztószalaggal rögzítjük az állathoz. Egy kis lyukat vágunk a ragasztószalagon, hogy a Telfa pólya egy kis helyen hozzáférhetővé váljon közvetlenül a seb felett. A Telfa kötésre 12 napon át, naponta kétszer 0,6 ml kontroli-oldatot (0,1 mólos ammónium-rdihidrogén-foszfát-oldat, pH = 7,3), vagy 0,6 ml, 75 illetve 150 pg IGF-II-t is tartalmazó kontroli-oldatot juttatunk. A kísérlet 5., 8. és 12. napján valamennyi seb nyílt részeinek területét meg-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
