200423. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a sebgyógyulást gyorsító, IGF-II-t tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
13 HU 200423 B 14 C) A pIGF2 plazmid emésztése és defoszforHálása A fentiek szerint izolált pIGF2 plazmid 5 jul-ét EcoRI enzimmel, 50 pl végtérfogatban emésztjük, lényegében a 4. példa A) pontjában leírtak szerint eljárva. Az emésztett plazmidot ezután fenol : kloroform 50 : 50 arányú elegyével extraháljuk, és lényegében a 4. példa A) pontjában leírtak szerint eljárva kicsapjuk. Az EcoRI enzimmel emésztett pIGF2 plazmidot ezután 100 jul foszfatáz-pufferban (10 mmól Tris-HCl, pH = 8,0; 1 mmól magnézium-klorid és 0,01 mmól cink-klorid oldata) feUzuszpendáljuk. ' A 4,2 kb nagyságú, EcoRI enzimmel emésztett, foszfatáz-pufferban felszuszpendált pIGF2 plazmidot 65 °C hómérsékleten 5 percen át inkubáljuk, majd 1 ml (7 egység, Boehringer-Mannheim) borjú intesztinális alkalikus fosztatáz enzimet adunk hozzá, öszszekeverjük, és a 65 °C hómérsékleten végzett inkubációt további 5 percen át folytatjuk. Ezt újabb 30 percen át, 60 °C hómérsékleten végzett inkubáció követi, majd a reakcióelegyet egyszer fenol : kloroform 50 : 50 arányú elegyével, egyszer pedig kloroformmal extraháljuk. Az extrakciók után a reakcióelegyhez 0,3 mól végkoncentrációban nátrium-acetátot, majd 3 térfogatnyi etanolt adunk, keverést és -70 °C hőmérsékletre való hűtést követően pedig az oldatot centrifugáljuk, hogy kiülepítsük a foszfatázzal kezelt fragmenst. Az így kapott DNS-csapadékot 25 ul TE-pufferban felszuszpendáljuk: az oldat körülbelül 4,5. jugi foszfatázzal kezelt, mintegy 4,2 kb nagyságú, EcoRI enzimmel emésztett pIGF2 plazmid DNS-t tartalmaz. t D) A ligálás és a transzformáció 1 pl, defoszforilált, EcoRI , enzimmel emésztett pIGF2 plazmidot adunk 4 m1> a 2. példában leírtak szerint eljárva elkülönített, trpLEl-et kódoló EcoRI restrikciós fragmenshez, és lényegében a 4. példa A) pontjában leírtak szerint eljárva ligálunk. A ligáit DNS alkotja a kívánt pIGF201 plazmidot. A pIGF201 plazmidot tartalmazó, ligáit DNS-sel transzformáljuk az E. coli K12 RV308 törzs sejtjeit, a 4. példa B)/2 pontjában leírt transzformációs eljárás szerint eljárva. A kívánt transzformánst, az E. coli K12 RV308/pIGF201 törzset plazmid DNS-ének elemzésével azonosítjuk. 5. példa Az Escherichia coli RV308/pCZ21 törzs előállítása A) A pCZ21 plazmid előállítása 1) A pCZ20 vektor-DNS mintegy 10,1 kb nagyságú EcoRI-BamHI fragmensének izolálása A 2. példa B) pontjában leírtak szerint eljárva előállított pCZ20 plazmid 5 Mg-ját lényegében a 4. példa A) pontjában leírtak szerint eljárva, BamHI és EcoRI restrikciós endonukleáz enzimekkel emésztjük. Az emésztett pCZ20 plazmid-DNS-t ezután lX-os agaróz gélen elektroforetizáljuk, és a kanamicin-rezisztencia gént, valamint az úgynevezett runaway replikont tartalmazó, 10,1 kb nagyságú EcoRI-BamHI fragmenst lényegében a 2. példában leírtak szerint eljárva elkülönítjük. A DNS csapadékot 25 m1 TE-pufferban szuszpendáljuk fel: az oldat 4 pg-ot tartamaz a pCZ20 vektor 10,1 kb nagyságú EcoRI-BamHI fragmenséből. 2) A pIGF201 plazmid 0,63 kb nagyságú, trpLEl-et és IGF-II-t kódoló, EcoRI-BamHI restrikciós fragmensének izolálása A 4. példa D) pontjában leírtak szerint eljárva előállított pIGF201 plazmid 30 Mg“ját BamHI enzimmel emésztjük, lényegében a 4. példa A) pontjában leírtak szerint eljárva. Kicsapás után a DNS-t 2 m1 10X EcoRI-puffer, 1 ,ul EcoRI restrikciós enzim (10 egység) és 17 m1 víz elegyében szuszpendáljuk fel. Az oldatot óvatosan keverjük, majd 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Egy perc elteltével 5 m1 reakcióelegyet eltávolítunk, és 1 m1 0,25 mólos etilén-diamino-tetraecetsav-oldattal keverjük, leállítva a reakciót. Hasonló módon, az inkubáció 2., 5. és 10. percében 5 mI-ös alikvotqkat veszünk, és 1 m1 0,25 mólos etilén-diamino-tetraecetsav-oldattal elkeverjük azokat. Valamennyi alikvotot 1,2%-os agaróz gélen elektroforetizáljuk, lényegében a 2. példában leírtak szerint eljárva. Egy kisméretű DEAE szűrőpapír-csíkot helyezünk a kívánt 0,63 kb nagyságú EcoRI-BamHI fragr mens elé, majd e DNS-t lényegében a 2. példában leírtak szerint eljárva összegyűjtjük és kicsapjuk. Az utolsó kicsapást követően a DNS-t 20 m1 TE-pufferban szuszpendáljuk fel: az oldat a kívánt trpLEl-et és IGF-II-t kódoló EcoRI-BamHI restrikciós fragmens 0,35 MS-ját tartalmazza. 3) A ligálás Az 5. példa A)/l) pontjában leírtak szerint eljárva előállított, 10,1 kb nagyságú EcoRI-BamHI fragmens 1 pl-ht, valamint az 5. 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
