200423. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a sebgyógyulást gyorsító, IGF-II-t tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
11 HU 200423 B 12 A IV, V és VI DNS-duplexet ligáivá állítjuk elő az IGF-II kódoló régiójának fennmaradó részét. , A ligálás eredményeként egyik végén Xbal, a másik végén pedig BamHI ragadósvégű DNS molekulát nyerünk. A ligálási terméket 10%-os poliakril-amid gélen tisztítjuk. 4. példa A pIOF201 plazmid előállítása A) A pIGF2 plazmid előállítása 5 Mg pBR322 plazmid DNS-t feloldunk 5 m1 TE-pufferban, majd 2 mí 10X BamHI puffert (1,5 mól nátrium-klorid; 60 mmól, 7,9-es pH-jú Tris-HCl; 60 mmól magnézium-klorid és 1 mg/ml szarvasmarha szérum albumin /BSA/ oldata), 1 m1 BamHI restrikciós enzimet (10 egység) és 12 m1 vizet adunk hozzá, óvatosan összekeverjük, majd 37 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. Az inkubációt követően a BamHI enzimmel emésztett DNS-t kicsapjuk, majd 2 m1 10X EcoRI puffer, 1 m1 EcoRI restrikciós enzim (10 egység) és 17 m1 víz elegyével felszuszpendáljuk. Óvatos keverés után a reakcióélegyet 37 °C hőmérsékleten, 2 órán ^t inkubáljuk. Az EcoRI- és BamHI enzimekkel emésztett pBR322 plazmid DNS-t egyszer fenol : : kloroform 50 : 50 arányú elegyével, majd tiszta kloroformmal extrahéljuk. A DNS-t kicsapjuk úgy, hogy az oldathoz 0,3 mól végkoncentrációban nátrium-acetátot adagolunk, 2,5-3 térfogat etanolt adunk hozzá, összekeverjük, -70 °C hőmérsékletre hűtjük, majd centrifugáljuk. A DNS-csapadékot a mintegy 5 Mg> EcoRI és BamHI enzimekkel emésztett pBR322 plazmid DNS alkotja. A DNS-t 25 m1 TE-pufferban felszuszpendáljuk, és az IGF-II-t kódoló szintetikus génfragmenssel való ligálásig -20 °C hőmérsékleten tároljuk. Az EcoRI és BamHI enzimekkel emésztett pBR322 plazmid 1 ul-éhez az EcoRI-Xbal, illetve az Xbal-BamHI ragadósvégű, IGF-II-t kódoló, a 3. példában leírtak szerint eljárva előállított DNS-fragmensek mindegyikéből 0,6 pmól-t keverünk. A DNS molekulák ligálását a 3. példában leirt ligálási eljárással lényegében azonos módon végezzük. A ligáit DNS-t továbbiakban az E. coli RV308 törzs sejtjeibe transzformáljuk. B) Az Escherichia coli RV308/pIGF2 törzs előállítása 1) Fagyasztott, kompetens Escherichia coli K12 RV308 sejtek előállítása 5 ml TY táptalajt oltunk az E. coli K12 RV308 (NRRL B-15624) törzs sejtjeivel, és a tenyészetet 37 °C hőmérsékleten, egy éjszaö kán át rázatva’ inkubáljuk. Az egy éjszakán át nőtt tenyészetet TY táptalajjal 1 1 végtérfogatra hígítjuk: a hígított tenyészet optikai denzitása t (600 nra-en) igy körülbelül 0,1 egység. A 37 °C hőmérsékleten rázatva végzett inkubálást addig folytatjuk, mig a tenyészet optikai denzitása (600 nm-en) eléri a 0,55-0,65 egység közötti tartományt; ekkor a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket 500 ml hideg, 50 mraól-os kalcium-klórid-oldatban felszuszpendáljuk, és az igy nyert szuszpenziót jégfürdőben 15-30 percen át inkubáljuk. A sejteket ezután centrifugálással összegyűjtjük, a sejtüledéket pedig 20 ml hideg, 20% glicerolt és 50 mmól kalcium-kloridot tartalmazó oldatban felszuszpendáljuk. A szuszpenziót 0,2 ml-es adagokban előhűtött csövekbe osztjuk szét; ezeket azonnal -70 °C hőmérsékletre hűtjúk, majd -70 °C-on tároljuk. A fentiek szerint eljárva előállított sejtek egy évig életképesek, és a transzformáció szempontjából kompetensek maradnak. ' 2) A transzformáció Az egyik, -70 °C hőmérsékleten tárolt, E. coli K12 RV308 kompetens sejteket tartalmazó csövet felmelegítjük, és annak tartalmát a 4. példa A) pontjában leirt eljárás szerint előállított, ligáit DNS-sel elkeverjük. A sejt-DNS-elegyet jógfürdőben 1 órán át inkubáljuk. Ezután a sejteket összegyűjtjük, a felülúszót előntjük, és a sejtüledéket 100 Mg/ml triptofánnal kiegészített, 0,5 ml TY táptalajban felszuszpendáljuk. 30 percen ét 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a sejteket 50 Mg/ml ampicillinnel és iOO Mg/ml triptofánnal kiegészített TY táptalaj-lemezekre szélesztjük. A táptalaj-lemezeket 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. 3) A. transzformánsok elemzése A kívánt transzformánsokat várt ampicillin-rezisztens, tetraciklin-szenzitiv fenotipusuk, valamint plazmid-DNS-ük elemzése alapján azonosítjuk. Mivel a pIGF-II plazmid teljes DNS-szekvenciája megjósolható, a transzformált E. coli sejtekből izolált plazmid DNS-t különböző restrikciós enzimekkel hasítva, az elektroforézist és a gél kiértékelését követően meghatározhatjuk, hogy a reakciótermékek azonosak-e az elméletileg meghatározott pIGF-II fragmensekkel. Az igy azonosított transzformánsok alkotják a kívánt. E. coli RV308/pIGF2 törzset. A pIGF2 plazmid előállítását és tisztítását lényegében az 1. példában leírtak szerint eljárva végezzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
