200345. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunglobulin és albumin előállítására 2-etoxi-6,9-diaminoakridin és kromatográfia kombinációjával
1 HU 200345 A 2 A találmány tárgya új eljárás gyógyszerkönyvi előírásnak megfelelő anti-D immunoglobulin, más specifikus immunglobulin frakciók, valamint albumin előállítására 2-etoxi-6,9-diaminoakridin és lcromatográfia kombinációjával. A plazmafehérjék ipari méretű előállítására még ma is többnyire az ún. hidegalkoholos eljárást alkalmazzák [Cohn és munkatársai: Plasma Protein Fractionation J.Am.Chem.Soc. ó&. 459 (1946)]. Ennek az.pl járásnak technológiai előnyei mellett azonban számos hátránya is van. Többek között a fehérjék denaturálódásának veszélye, a hűtés nagy energiaigénye és elsősorban az, hogy a hepatitis vírus minden alkoholos eljárással előállított frakcióban kimutatható [Duana D. Schoeder, Milton M.Mozen: Australia Antigen: Distribution during Cohn Etahanol Fractionation of Human Plasma (Cutter lab.) Science, 168. 1462 (1964)]. A kromatográfiás anyagok felfedezése (Prath, J. és Flodin, P. Nature 183,1959) és gyártása ezeknek mind szélesebb körű alkalmazását tette lehetővé, így az utóbbi években több plazmafrakcionáló eljárást is kidolgoztak [Curling, J.M., Berglöf, J.H., Lindquist, L.O., Erikson, S., Vox Sang. 13, 97-107 (1977); AD. Friesen, J.M.Bowman, W.C.H. Bees, Nemzetközi Heamatológiai Társaság 19. és Nemzetközi Vártranszfúziós Társaság 17. Kongresszusa, Budapest, 1982.08.01-07., Kongresszusi Közlemény 117-126.oldal], gélszűrők és ioncserélők kombinált alkalmazásával. E módszerekkel sem tudták azonban megoldani a nyert plazmafrakciók hepatitis vírus mentesítését. Az utóbbi évek során a plazmafrakciók vírusmentesítésére új, az ún. rivanolos eljárást dolgozták ki [H.Geiger, Th.Kranz and Haupt, The Fate of Australia Antigen during Plasma Fractionation 13th International Congress of IABS, Budapest: Part A: Purification of Proteins; Develop.biol.Standard, 22, 158-165, 166-171 (Karger, Basel 1974); N. Chariatte, Hepatitis B: Au/Ha-Antigen during production of Human Albumin and Gammaglobulin, 13th International Congress of IABS, Budapest 1973: Part A: Purification of Proteins], Ezen eljárások szerint a sómentesített vérplazmából az albumint rivanollal (2-etoxi-6,9-diaminoakridin-laktát) választják le miközben a pH-t nátriumhdiroxid-oldattal 7,5—8,0 értékre állítják be. A további tisztítási eljárások előtt azonban a rivanolt úgy az albumin frakcióban, mint a gammaglobulin frakcióban el kell távolítani. Ezt a műveletet a szakirodalmi adatok szerint aktív szénen való adszorpcióval végzik 6,0 pH érték felett (A.R. Neurath, Z. Malik und C. Altner: Immunichemisches Studium eines modifizierten Verfahrens zur Gewinnung von Immunglobulinen Zeitschrift für Immunitätsforschung und experimentelle Therapie mittels Rivanol 121. 240, (1961). Ez a rivanolmentesítésre szolgáló eljárás azonban nagy immunglobulin veszteséggel jár, a termelés a kiindulási plazmára vonatkoztatva 10— 20%. A rivanol nagy részének eltávolítása elvégezhető nátriumkloridos „kisózással" is, de a kisózás után aktív szenes derítést is alkalmaznak, végül a magas nátriumklorid kocentráció (3—10%) miatt még sólalanítást is kell végezni. Az eljárás bonyolultsága miatt üzemi megvalósításra nem alkalmas. A rivanolmentesítésre ajánlják a kromatográfiás módszert is, üzemi méretekben azonban ez a módszer sem kivitelezhető, mivel a gélhez kötött rivanolt hangyasavval kell lemosni Frantisek Franek: Purification of IgG Monoclonal Antibodies from Ascitic Fluid Based on Rivanol precipitation [Matods in Enyzmologz, 121,631,(1986)]. A találmány célja a várplazma vírusmentesítésére ismert eljárások hátrányainak kiküszöbölése olyan egyszerű nagyüzemi méretekben is megvalósítható eljárással, amely az eddigi eljárásokhoz képest lényegesen magasabb termelést is biztosít a kinyerhető fehérjefrakciókra nézve. A találmány alapja az a felismerés, hogy a vérplazma albumin frakciójának kicsapásához és egyben a plazma vírusmentesítéséhez rivanol helyett a 2-etoxi-6,9-diaminoakridin vizes szuszpenzióját (elkészítését az 1. példában ismertetjük) adagolva a tejsavval 4,6—4,8 pH értékre beállított plazmához, a pH érték folyamatosan emelkedik, pH 7,5—8,0 érték elérésekor az albumin kicsapódik. Az előzőekben ismertetett, szakirodalomban található eljárások az albumin kicsapódásához a rivanol vizes oldatát alkalmazzák és a pH értéket nátriumhidroxid vizes oldatával állítják be 7,5—8,0 értékre, így a bevitt ionok mennyisége lényegesen több, illetve az ionerősség lényegesen magasabb lesz, mint a mi eljárásunk során, ez atovábbi feldolgozásmenetét befolyásolja és valószínűsíti az alacsony termelési szinteket, melyek a szakirodalomban fellelhetők. A szakirodalomban ugyan fellelhetők olyan adatok, melyek szerint az albumin kicsapásakor 2-etoxi- 6,9-diamino-akridin-albumin komplex keletkezik [SzJL Tukacsinszkij i VP.Mojszejeva: Szvjazivanyije rovanola v szivorotocsnimi belkami, Biochimija 26,1 (1961); Mitterhauzerova, K. Králová and L.Krasnec: Interaction of human serum albumin with acridine and phenazin Chem. Zvesti, 32,124, (1978)], azonban az albumin kicsapásához minden esetben rivanolt alkalmaznak. A kicsapási pH érték beállítása ezekben a leírásokban is nátriumhidroxid vizes oldatával történik. A szakirodalmi adatok alapján a kicsapott albuminfrakcióból és a kicsapás után kapott immunoglobulinokat tartalmazó frakcióból a rivanolt szenes adszorpcióval távolítják el pH 6,0 vagy ennél magasabb pH értéken. Kísérleteink során azt a meglepő megfigyelést tettük, hogy az aktív szenes adszorpciót 4,1 pH értéken végezve a kiindulási plazmához képest az immunglobulin termelés jelentősen fokozódik, ugyanis ezen a pH értéken az általunk alkalmazott 2-etoxi-6,9-diamino-akridinnem ad komplexet az immunglobulinekkel és így nem kötődik fel az aktív szénre. Eredményeinket az 1. ábrában mutatjuk be, ahol az aktív szénnel történd adszorbeáltatás után, centrifugáltunk és a felülúszóban az immunglobulin koncentrációt mértük a szenezésnél alkalmazott pH érték függvényében. A fiziológiás pH értéktől való ilyen nagy eltérés nem jelent denaturációs veszélyt,hiszen az aggregáció elkerülésére ma már ilyen PH értéken hoznak forgalomba immunglobulin készítményeket intravénás célra (R.Tenold és mtsai: Properties and Charavterities of a new immunglobulín-G intravenus preparation. Reviews of 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
