200345. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunglobulin és albumin előállítására 2-etoxi-6,9-diaminoakridin és kromatográfia kombinációjával
3 HU 200345 A 4 infectious Dis., fi, Supplement 4., July-August 1986). A találmány tárgya eljárás immunglobulin és albumin előállítására 2-etoxi-6,9-diaminoakridin és kromatográfia kombinációjával, melynek során anti-D immunglobulint tartalmazó plazma, normál vérplazma, fibrinogén-mentesített plazma, alvadási faktoroktól mentesített plazma sótalanítását a szakirodalomban megadott módon gélszűréssel (Vox.$ang 11,97-107 (1977)] végezzük, majd az eluátum pH értékét vizes tejsavoldattal 4,6—4,8, előnyösen 4,7 értékre állítjuk és a 2-etoxi-6,9-diaminoakridin steril desztillált vizes szuszpenzióját (készítését az 1. példában írtuk le) adagoljuk, amíg a pH érték a 7,2—7,8, előnyösen 7,5 értéket éri el, ezután még legalább 15 percig, előnyösen 30 percig keverjük a reakcióelegyet, majd előnyösen 20 perc állás után a csapadékról (ifrakció: albumin frakció) a felűlúszót leszivatjuk (IlJrakdoiimmunglobulin frakció) pH értékét vizes tejsav oldattal 4,0—4,2, előnyösen 4,1 értékre állítjuk a kiindulási plazma térfogatára számított 2,2—2,9, előnyösen 2,4 súly% aktív szenet adagolunk, Seitz szűrőn, vagy szupercentrifugán a szenet eltávolítjuk, majd membránszűrőn, előnyösen 0,2 mm Millipore szűrpn önmagában ismert módon sterilre szűrünk. A szűrletet a továbbiakban a szakirodalomból [Vox Sang fii 97- 107 (1977)] ismeretes ioncserélős tisztítási eljárások bármelyikével tisztítjuk (például 5. példa szerint 5,0%-os, 99% feletti tisztaságú) és liofilizáljuk- AzLtalbumin frakció 2-etoxi-6,9-diamino-akridinmentesítése megegyezik a II. frakciónál leírt módszerrel, az aktív szenezés után kapott szűrletet a továbbiakban a szakirodalomban ismertetett ioncserélős tisztítási eljárások bármelyikével 20,0%-os, 99% feletti tisztaságú készítménnyé dolgozunk fel (pL 4.példa szerint). A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a. ) alkalmazásával a vírusmentesített vérplazma frakciók a szakirodalmi adatokban megadott 10— 20%-os termelése 30—40%-ra emelkedik; b. ) az eljárás nagyüzemileg is kivitelezhető; c. ) a tisztítás után nyert vérplazma frakciókminősége a gyógyszerkönyvi előírásoknak megfelel. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban ismertetjük: 1. példa 2-etoxi-6.9-diamino-akridin Vizes oldatának elkészítése 80 *C hőmérsékletű sterü pirogénmentes desztillált vízben állandó keverés mellett 70 g rivanolt (2- etoxi-6,9-diamino-akridin-laktát) feloldunk, majd steril pirogénmentes desztillált vízzel 1000 milliliterre egészítjük ki a térfogatot, hűtés után állandó keverés mellett 170 milliliter 1 mólos nátriumhidroxidot adagolunk, 30 percig keverjük a reakcióelegyet A kivált csapadékot szűrjük és sterU desztülált vízzel lúgmentesre mossuk. A kivált 2~etoxi-6,9-diaminö-akridin csapadékot nedves súlyával azonos térfogatú steril pirogénmentes desztillált vízben szuszpendálva szobahőmérsékleten tároljuk. 2. példa A plazma sótalanítása és az T (alhuminlfrakdó kicsapása 25 liter vérplazmát 4,0 pH-jú, 1,0 milli Siemens vezetőképességű, 0,02 mólos nátriumlaktáttal egyensúlyba hozott Sephadex G-25 Coarse jelű [Pharmazia katalógusszám 17-0034-01(02)] gélszűrővel töltött Sephamatic CF-6 jelű (Pharmacia katalógus szám KS 370) oszlopon sótalanítunk. A sótalanítást 12—13 literes cildusokban végezzük. Az eluált sótalanított plazmát 100 literes rozsdamentes tartályban gyűjtjük. Az összegyűjtött plazma pH értékét 1 mólos tejsavoldattal állandó keverés mellett pH 4,7 értékre állítjuk és a keverést folytatva 2-etoxi-6,9-diaminoakridin desztillált vizes szuszpenzióját (készítését lásd 1. példában) adagoljuk 7,5 pH érték eléréséig (1300 ml). A 7,5 pH érték elérése után a keverést még 30 percig folytatjuk, majd az elegyet 20 percig állni hagyjuk, majd a kivált csapadékról (I. frakció albumin frakció) a felűlúszót (II. frakció immunglobulin frakció) leszívjuk. 3. példa A 2. példa szerint nyert I. és H. frakció 2-etoxi- 6.9-diaminoakridin-mentesítése A 2. példa szerint nyert a kiindulási plazma térfogatával azonos mennyiségű (25 liter) steril pirogénmentes desztillált vízzel hígított csapadék (I frakció albumin frakció), illetve a 2. példa szerint nyert felűlúszót (H. frakció immunglobulin frakció) pH-ját állandó keverés közben 1 mól tejsavval pH 4.1 értékre állítjuk, majd a keverés tovább folytatva 600 g aktív szenet adagolunk, a szenet mely a 2- etoxi-6,9-diaminoakridint adszorbeálja Seitz szűrőn szűrjük, vagy szupercentrifugán centrifugáljuk, a nyert szűrletet, illetve a felűlúszót 0,2 nm Millipore szűrőn engedjük át, majd a kapott 2-etoxi-6,9- diamin oakr id in -men tes albumin-, illetve immunglobulin frakciót ismert módon, előnyösen kromatográfiás tisztítással megfelelő albumin-, illetve immunglobulin készítményekké dolgozzuk fel (lásd 4. és 5. példa). 4. példa A 3. példa szerint nyert 2-etoxi-6.9-diaminoakridin-mentes albumin frakció (I. frakció) kromatográfiás tisztítása (30/87 asz. „Eljárás sárgaszínű, stabil humán albumin oldat előállítására emberi vérplazmából’* c. magyar szabadalmi bejentésünk szerint) A 3. példa szerint nyert 2-etoxi-6,9-diaminoakridin-mentes albumin oldathoz (I. frakció) állandó keverés mellett 1 mól nátriumkaprilátot adagolunk 5.2 pH érték eléréséig. Az elegyet 30 percig kevertetjük, majd szupercentrifugáljuk, a kapott felülúszót 0,2 nm Millipore szűrőn szűrjük, majd a szűrléét vezetőképességét desztillált víz adagolásával 1,6 milli Siemens értékre, pH-ját 1 mól nátriumhidroxiddal 5,2 értékre állítjuk és 5,2 pH-jú 1,6 milli Siemens vezetőképességű 0,02 mólos nátriumacetit pufferrel egyensúlyba hozott DEAR Sepharose FF jelű (Pharmacia készítmény) anioncserélő gyantaoszlopra (16 liter) visszük fel. Az eluciót három lépcsőben a következő puff erekkel végezzük: 1) 0,02 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
