200277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hatóanyagként humán XIII faktort tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 HU 200277 B 6 dózisban intravénásán adagoltuk. A kezelés során csökkent a véres széklet, a székelés utáni vérzés és a has felpuffadása. Növekedett a székelés gyakorisága. A kezelés harmadik napja után nem lehetett vért kimutatni a székletben. A negyedik utókezelési napon a betegnek ismét véres széklete volt és hasi fájdalmai voltak. Ismét két napig intravénásán 1500 egység/nap dózisban intravénásán XIII faktor-koncentrátumot adagoltunk. A negyedik utókezelési napon elmúltak a hasi fájdalmak és egyéb hasi tünetek, valamint nem lehetett vért kimutatni a székletben és a székelés gyakorisága az ötödik utókezelési napon normalizálódott. Az első sorozat után a negyedik napon vastagbéltökrözést végeztünk, amellyel megállapítottuk, hogy a nyálkahártya sérülése a szigmoid bél közepénél és attól lejjebb, valamint spontán vérzés már csak korlátolt területeken volt tapasztalható, habár kontakt vérzést az elszívásnak köszönhetően néhány helyen még megfigyelhető volt és a vérerek átláthatósága jelentősen javult. Ez a vastagbéltükrözés észrevehető javulást mutatott az előkezelésekkel összehasonlítva, amelyben bér a beteg még gyógyítás alatt állott, mégis a klinikai tünetek újból megjelentek. 4. eset: (beteg: férfi, 54 év, 68 kg) A betegnek hasmenés tünete volt. 1986 novemberi vastagbéltükrözés rendellenességeket tárt fel a nyálkahártyában, amely a harántos vastagbélig tartott, valamint a pszeudopoliphoz hasonló kiemelkedéseket, a szigmoidbélben vérzést és vörösödést derített fel. Ulcerativ colitisre gyanakodtunk, így három napon keresztül 2000 egység/nap dózisban XIII faktor-koncentrátumot intravénásán adagoltunk. A kezelés második napján csökkenni kezdett a véres hasmenés és a hasi fájdalom és az utolsó kezelést követő harmadik napon teljesen elmúltak ezek a panaszok. -Az utolsó adagolás után végzett vastagbéltükrözés feltárta, hogy a szigmoidbélig tartó nyálkahártya görcsös és a vérzések megszűntek, habár néhány pszeudopolip még mindig észrevehető volt. Eljárás XIII faktor-koncentrátum előállítására A XIII faktort ismert módszerrel állítjuk elő humán placentánból vagy plazmából. A következőkben olyan előállítási példát közlünk, amelyben nyersanyagként humán placetát alkalmazunk. A piacentét lefagyasztjuk, majd apró darabokra törjük. A felapritott placentához NaCl oldatot adunk, keverjük és az I. felülúszót centrifugálással összegyűjtjük. Miután enzim iminunoassay-vel megállapítottuk, hogy ez a I. felülúszó HBs antigént nem tartalmaz, hozzáadunk Rivanol oldatot és összegyűjtjük a II. csapadékot, amely a XIII faktort tartalmazza. A csapadékot, mossuk, majd hozzáadunk EDTA-t tartalmazó NaCl oldatot és keverjük. Az oldhatatlan anyagokat (III csapadék) eltávolítjuk, és megkapjuk a III. felülúszót. A III. felülúszóhoz adunk N-acetil-piridinium-klorid oldatot, hogy a szennyező proteineket és mukopoliszacharidokat kicsapjuk. Az így kapott IV. felülúszóhoz adunk Rivanol oldatot és igy kialakul az V. csapadék, amely a XIII faktort tartalmazza. Ehhez a csapadékhoz adunk EDTA-t tartalmazó NaCl oldatot és eltávolítjuk a nem oldódó anyagokat (VI. csapadék) és megkapjuk a VI. felülúszót. A VI. felülúszóhoz adunk ammónium-szulfátot, így a XIII faktort tartalmazó VII. csapadékot nyerjük. A VII. csapadékhoz EDTA oldatot adunk, majd EDTA-t és nátrium-azidot tartalmazó trisz-HCl pufferral szemben dializáljuk. A pH beállítása után eltávolítjuk a VIII csapadékot és az igy előállított VIII felülúszót gélszűrésnek vetjük alá, amellyel összegyűjtjük az aktiv frakciókat. A frakciókhoz adunk (NH^hSO-i-t és összegyűjtjük a XIII faktort tartalmazó IX csapadékot. Ezt a IX csapadékot EDTA-t tartalmazó trisz-HCl pufferban feloldjuk, ugyanezzel a pufferral szemben dializáljuk és a pH-t beállítjuk, és az euglobulin formájú XIII faktort tartalmazó csapadékot összegyűjtjük. Az euglobulin csapadékot EDTA-t tartalmazó NaCl oldatban feloldjuk és hozzáadunk esetsavanhidridet és szukrózt. Ezután a kivált X. csapadékhoz - amely a XIII faktort tartalmazza - ammónium-szulfátot adunk és ezt a X. csapadékot EDTA-t tartalmazó NaCl oldatban feloldjuk és ugyanezzel a pufferral szemben dializáljuk. A XIII faktor titerét glükózt és humán szérum albumint tartalmazó NaCl oldattal beállítjuk. Az így kapott oldatot strilen szűrjük, ampullákba adagoljuk és liofilizáljuk. Az itt közölt frakcionálási módszeren kívül a XIII faktort még géntechnológiai úton is előállíthatjuk. A találmány szerinti XIII faktor-készítmények felölelik az összes XIII faktor-készítményt, amelyeket bármilyen lehetséges módon állítottak elő, beleértve a frakcionálási és a géntechnológiai módszereket is. Mivel a frakcionálási módszerrel előállított XIII faktor készítmények tartalmazhatják a hepatitis vírust, az AIDS vírust, stb. ezért kivánatos ezeket a vírusokat hőkezeléssel vagy más módon inaktiválni. A hőkezelést a következőképpen végezzük: Az euglobulin formájú XIII faktort tartalmazó csapadékot EDTA-s NaCl oldatban feloldjuk és az oldatot 60 °C hőmérsékleten 10 óráig állni hagyjuk vagy az inkubálás során alkalmazhatunk stabilizálószerként aminosavat (például glicint), hidrokarbonát oldatot is. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
