200192. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF-analóg peptidek előállítására
HU 200192 B való hozzáadás előtt összekapcsolunk. A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása ismert a szakmai gyakorlatból . A kapcsoló reagensként különösen jól használható az N,N’-diciklo-hexil-karbodiimid (DDCCI). A peptídek szilárd-fázisú szintézisében használt aktiváló reagensek jól ismertek a peptidkémiában. A megfelelő aktiváló reagensekre példa a különböző karbodiimidek, például az N.N’-diizopropil-karbodiimid, és N-etil-N’ -(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid. A többi aktiváló reagenst és használatukat a peptídek kapcsolásában Schroder és Lubke faja le idézett művük m fejezetében, valamint Kapoor [L Pharm. Sei- 59.1—27 (1970)]. Minden egyes védett aminosavat vagy oligopeptidet négyszeres vagy nagyobb feleslegben juttatjuk a szilárd fázisú reaktorba, és a kapcsolást dimetilformamid (DMF):diklórmetán 1:1 arányú elegy ében vagy tiszta DMF-ben vagy diklórmetánban hajtjuk végre. Olyan esetekben, ha a kapcsolás nem játszódik le teljesen, a kapcsolási eljárást a következő aminosav kapcsolását megelőzően, az alfa-amino védőcsoport eltávolítása előtt megismételjük. A szintézis minden lépésében a kapcsolási reakció sikerét előnyösen a ninhidrin-reakckSval ellenőrizzük [Kaiseret al.. Anal. Biochem.. 34.595 (1970)]. A kapcsolási reakciót automatizálva is végezhetjük, például Beckman 990 automatikus szintetizátorral, a Rivier és munkatársai által leírt programot alkalmazva fBiopolvmers. 17.1927-1938 (1978)]. A kívánt aminosav-sorrendű vegyület létrehozása után az intermedier pepiidet megfelelő reagenssel, például folyékony hidrogén-fluoriddal eltávolíthatjuk a gyanta hordozóról a reagens ezenkívül lehasítja az összes, azaz az X, X2, X3, X4, X5, Xó, X7 és Xs védőcsoportot, azaz X9 kötést, és ha van, az Xi alfaamino védőcsoportot, így kapjuk a kívánt pepiidet szabad sav formájában. Ha metionin található a pepiidben, előnyösen a BOC védőcsoportot távolítjuk el először, trifluorecetsav (TFA)/etánditiol elegyet használva a pepiidnek a gyantáról való hidrogénfluoridos lehasítása előtt, ezzel kiküszöbölve a lehetséges S-alkilezést Ha hidrogén-fluoridot használunk a hasításhoz, anizolt és metiletil-szulfidot teszünk a reakció-elegyhez, a melléktermékek eltávolítására. A következő példákban a peptídek szintézisének előnyös, a szilárdfázisú technikát alkalmazó módszerét mutatjuk be. Nyilvánvaló, hogy a megfelelő rövidebb peptid-fragmensek szintézisét azonos módon végezzük, elhagyva aminosavákat a lánc bármelyik végéről; jelenleg azonban úgy tudjuk, hogy a biológiailag aktív fragmenseknek a jelzett szekvenciát kell tartalmazniuk az N-terminális végen. 1 1. példa A CaMe-pCl-Phe-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg -Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Gly-NHz képletű (CaMe-pCl-Phe-hGRF(l—32)NH2 peptid szintézisét lépésenként hajtjuk végre Beckman 990 peptid-szintetizátorral, körülbelül 0,1—0,5 mmól/g gyanta helyettesítési tartományban MBHA gyantán. A peptidlánc lépésenként történő felépítése során a védőcsoportok lehasítását, a semlegesítést és az 5 egyes aminosavak kapcsolását általában a Vale és munkatársai által és a 4.292.313. sz. Amerikai Egyesük Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett módszer szerint végezzük. A felhasznált összes oldószert gondosan levegőmentesítjük semleges gáz, például hélium vagy nitrogén átbubarékoltatákval, a metionin kénatomjának nemkívánatos oxidálódását okozó oxigén távoltartásának biztosítása céljából. A védőcsoportok lehasítását előnösen az A séma szerint hajtjuk végre: A séma 6 Reagens Keverési idő (perc) 60% TFA/2% etán-ditiol 10 60% TAF/2% etán-ditiol 15 IPA/1% etán-ditiol 04 EtáN (10%) CHjCb-ben 04 MeOH 04 EtäN (10%) öcCfe-ben 04 MeOH (kétszer) 0,5 Ch2Cl2 (kétszer) 0,5 A kapcsolásokat előnyösen a B séma szerint hajtjuk végre: B séma Reagens Keverési idő (perc) DCCI ___ Boc-aminosav 50-90 MeOH (kétszer 04 CHmo2 (kétszer) 04 AczO (3m) CteCte-ben 15,0 CI12CI2 04 MeOH 04 CH2CI2 (kétszer) 04 • Egy gramm gyantára számítva egy vagy két mmól BOC-védett aminosav diklórmetános oldatát használjuk, DCCI1,0 mólos, dDdórmetános oldatával két órán át. BOC-Arg (TOS) kapcsolása esetén 50%-os DMF és diklórmetán elegyet használunk. Bzl-étert használunk a Ser és Thr oldal láncában szereplő hidroxilcsoport védelmére. Az Asn vagy Gin amido-csoportját Xan védőcsoporttal védjük, ha az előnyös DCC kapcsolást használjuk. P-nitrofenil észtert (ONp) is használhatunk az ASn vagy Gin karboxilvégének aktiválására, a BOC-Asn (ONp)-t például éjszakán át kapcsolhatjuk egy ekvivalens HOBt 50%os DMF-diklór-metános oldatát használva, amely esetben DCC hozzáadására nincs szükség. 2-klórbenziloxikarbonil (2 Cl-=) csoportot használunk a Lys oldalláncának megvédésére. Tos-csoportot használunk az Arg guanidino-csoportjának, valamint a His nitrogénatomjának megvédésére és a Glu vagy Asp oldaüáncbeli karboxil-csoportját OBzl-csoporttal védjük. A Tyr fenolos hidroxil-csoportját 2,6-diklór-benzil (DCB) csoporttal védjük. A védett peptíd-gyanta komplex elhasítása és a védőcsoportok eltávolítása céljából a peptíd-gyantát egy grammjára számítva 1,5 ml anizoűal, 04 nú me-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
