200192. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF-analóg peptidek előállítására
HU 200192 B . I i « i 7 8 tíl-etíl-szulfiddal és IS ml hidrogén-fluoriddal kezeljük —20 *C-on fél órán át, majd 0 *C-on újabb föl órán át. Miután a hidrogénfluoridot csökkentett nyomáson eltávolítottuk, a gyanta-peptid maradékot váltakozva szárazra dietiléterrel és kloroformmal mos- S suk, majd a pepiidet gázmentesített 2 n vizes ecetsavval extraháljuk és szűréssel elválasztjuk a gyantától. A terméket 100%-os hatásfokkal hasítjuk le. A lehasított és védőcsoport-mentesített pepiidet ezután 0—5%-os ecetsavban oldjuk, majd tisztítjuk, 10 amely történhet Sephadex G—50 finom gél-szűréssel. A pepiidet ezután tovább tisztítjuk preparatív vagy fél-preparatív HPLC-vel. Rivier és munkatársai ÍPeotides: Stnictire and Biological Function 125—8, IS (1979)], valamint Maiid és munkatársai fJ. Amer. Chem. Soc.. 103.3178 (1981)] leírása alapjáa A Waters Associates preparatív LC—500-hoz csatlakozó oszlopokat Vydac (300A) IS—20 Cis szilikáttal töltöttük meg. TEAP-banacetonitrilgradienstkészítünk 20 alacsony-nyomású Eldex gradiens-készítővel, J. Rivier FLiq. Chromatography 1. 343—367 (1978)] módszerével. A kromatográfiás frakciókat alaposan . ellenőrizzük HPLC-vel és csak a megfelelő tisztaságú frakciókat egyesítjük. Az egymástól függetlenül 25 ellenőrzött tisztaságú kromatográfiás frakciók sómentesítését 0,1%-os TFA-ban készített acetonitril gradienssel végezzük. A középső vágást ezután liofilezve kapjuk a kívánt peptidet, amelynek tisztasága nagyobb lehet 98%-nál. A tennék forgatóképessége 30 [ar*D= -60,9* (c= 1; 1%-os ecetsavban). 2. példa Az alábbi peptídek szintézisét lépésenként hajtjuk végre MBHA gyantán, Beckman 990peptid szinted- 35 zárorral, amint azt Vale és munkatársai a 4.292.313. számú amerikai szabadalomban általánosan ismertetik. A peptidek lényegében tisztának minősülnek vékonyréteg-kromatográfiás és HPLC vizsgálat alapján: 40 Peptid [aJ^D (c= 1:1%-os ecetsavban) NoMePhe1 hGRF (1—32>NH2 NoMeTyr1, Nie27 iGRF (1—29)-NH2 D-Leu17, Nie27 iGRF (1—29>NH2 NoMeTyr1 hGRF (1—32)-NH2 D-Leu", Nie27 rGRF (1—29)-NH2 D-Glu25, Nie27 rGRF (1—29)-NH2 —61,1* —51,7* —5U* —60,5’ —533’ —50,6* 45 50 tálában mindegyiknek nagyobb hatása van a GH kiválasztására, hasonló belső aktivitás mellett. A szintetikus peptidek a növekedésihormon kibocsátását fokozó hatásának meghatározására standard 55 anyagként szintetikus hGRF (1—40)-OH-t használunk in vitro vizsgálatokban, ekvimoláris koncentrációkban. 3—5 nappal korábban eltávolított patkány hipofízisből származó sejteket tartalmazó tenyészeteket használunk. A növekedési hormon kiválasztására 60 optimálisnak ítélt tenyészeteket használunk gj. összehasonlító vizsgálatokban, melyeket általánosan Vale és munkatársai írnak le [Endocrinology, 21, 562— 572 (1972)], majd részletesebben Vale és munkatársai írják le [Endocrinology (1983), in press]. A tényé- 65 szelet 3—4 órán át inkubáljuk a vizsgált vegyülettel, majd a tenyészléből alikvot részeket veszünk ki, azo-. kát feldolgozzuk és egy jól jellemzett radioimmunológiás vizsgálati módszerrel mérjük az immunoreaktív GH (irGH) tartalmukat Az ekvimoláris koncentrációkra vonatkozó összehasonlító vizsgálatok eredményét az 1. táblázatban mutatjuk be: 1. Táblázat Peptid összehasonlítás (%) hGRF (1-40)—OH (standard ebben a vizsgálatban) [D-Glu", Nle"j-iGRF(l—29)-NHz [D-Leu2", Nle*j-rijRF(l—29)-NIfc [D-Leu17, Nlen-rGRFÍ 1—29)-NIfc [NaMePhe^-hGRFÍl—32)-Nífe [CaMe-pCl-Phe1 ] -hGRF( 1—32)-NH2 100 125 160 138 12 4,7 Ezeknek a szintetikus peptideknek in vitro vizsgálata azt mutatja, hogy mindegyik rendelkezik a hGRF(l—40)-OH teljes belső biológiai aktivitásával. A [D-Leu17, Nle27]-rGRF(l—29)-NIfe maximális hatásos koncentrációja körülbelül 1 nanomól. A növekedési hormon kiválasztásával végzett in vitro vizsgálatok mellett in vivo kísérletekben beépített katéteren keresztül a szintetikus peptideket szabadon mozgó, normál patkányokba injektáljujk, melyeket előzőleg FLA-63-mal, egy dopamin-hidroxiláz inhibitorral kezeltünk. Az FLA-63 elnyomja a spontán GH kiválasztást anélkül, hogy befolyásolná az exogén GRF-re adott választ Az említett katéteren keresztül közvetlenül az injektálás előtt, majd 5, illetve 20 perccel utána vér-mintát veszünk. Aradioimmunológiás vizsgálattal mért GH szintek azt mutatják, hogy a szintetikus [D-Leu23, Nle27]-iGRF(l— 29)-NH2 és a hGRF(l—32J-NH2 1. és 2. példa szerinti NaMe- és CaMe analógjai erősen serkentik a hipofízis GH kiválasztását, és lényegesen hosszabb ideig hatnak, mint az iGRF(l—29)-NH2 és hGRF(l-r- 32)-NH2. Ezeknek az eredményeknek a megerősítésére más közismert, a GH kiválasztása kimutatására alkalmas GRF in vivo vizsgálati módszereket használunk. Testsúlykilogrammra számítva 100 nanogramm—50 mikrogramm közötti dózisokat tekintünk Gh kiválasztásában hatékonynak. Az ilyen szintetikus hGRF és rGRF analógok humán alkalmazása hasznos abban az esetben, ha az orvos növelni kívánja a GH termelést A GH kiválasztásnak ilyen analógokkal való serkentése fontos olyan betegeknél, akiknél az endogén GRF alultermelése miatt részleges vagy teljes a GH-hiány. A megnőtt GH kiválasztás és velejáró növekedés-gyorsulás elérhető emberekben vagy állatokban normál GH szinttel. Az adagolás továbbá megváltoztatja a test zsírtartalmát és módosít más GH-fíiggő metabolikus, immunológiai és fejlődési folyamatot A találmány szerinti szintetikus vegyületek például hasznosak anabolitikus folyamatok serkentésében égési sérüléseket szenvedett embereknél. Másik felhasználási mód például a melegvérű állatoknak, például csirkéknek, 5
