200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
7 HU 200093 B 8 HîÇ ---- N HîC C — W (CHî-CHî-NHJ-îH Ci7Hî3-CO-NH-(CHz-CHî-NH)3-H HîC-----N I ■ HîC C — W \ / N I CHî-CHî-NH-CO-Z ahol W jelentése R, Z jelentése Ri szénhidrogén-részének jelentésével azonos. Az NMR ('H, UC és 15N) spektroszkópia igazolta a fenti szerkezeteket. A fenti vegyületeket, illetve azok elegyét (a továbbiakban: CDM) az alábbi biológiai vizsgálatokban teszteltük:- az anyag biológiailag hatékony hígítás-tartományának meghatározása. Az alkalmazott dózisokat higitási egységekben adjuk meg;- a CDM in vitro toxicitásának és a CDM hatás reverzibilitásának vizsgálata. A kísérletek során az alább felsorolt anyagokat és módszereket alkalmaztuk: Sejtvonalak. Normál szöveti eredetű sejtvonalak: McCoy: synovialis eredetű humán monolayer vonal, BHK: újszülött hörcsög vese eredetű fibroblaszt típusú monolayer vonal, BHK-B és BHK-Tübingen változatokban, HAK: felnőtt hörcsög vese eredetű monolayer vonal, MRC-5: humán embrionális tüdő eredetű monolayer vonal. Tumor eredetű sejtvonalak: LLC: egérben in vivo is fenntartható humán bronchialis carcinoma eredetű monolayer vonal, 70-80% epitheloid jellegű sejtet tartalmaz, HeLa-S3: humán cervicalis carcinoma eredetű vonal kiónja, K562: erythroid leukémia eredetű szuszpenziós vonal, SP2: egér myeloid leukémia eredetű szuszpenziós klón, P388: egér lymphoid leukémia eredetű szuszpenziós vonal, L-1210: egér lymphoid leukémia eredetű, ascitesben is fenntartható vonal. Sejttenyészetek. A sejtvonalakat Minimum Essential Médiumban (MÉM) tartottuk fenn 10% magzati borjúsavó (fetal calf serum = = FCS) jelenlétében (Flow Laboratories Ltd). A bakteriális fertőzések elkerülésére 50 jug/ml mennyiségű gentamycint alkalmaztunk (SERVA). A tenyészetek fenntartását 25 cm2- -es Falcon típusú műanyag szövettenyésztő M* : m/z W 390 L 392 O M* : m/z = 410 M* : m/z (W, Z) 609 (L, L) 611 (L, O) 613 (O, O) edényekben végeztük (NUNC v. Greiner v. Costar) 10 ml térfogatban. A monolayer kultúrákat 0,05% tripszinnel passzáltuk, a szuszpenziós kultúrákat higitással. A CDM teszteléséhez 24-edényes szövettenyésztó .multiplate'-eket használtunk 1 ml/well (= 2 cm2) médiummal. A tenyészeteket 37 °C-on növesztettük 5% CÛ2 tartalmú atmoszférában, melynek vízgőzzel való telítéséről folyamatosan gondoskodtunk (rel. humidités: 75-80%). A logfázisú sejteket a kontakt gátlást (v. növekedési platót) mutató kultúrák tízszeres hígításával nyertük. A kontakt gátlás állapotát monolayer kultúrák esetén a mikroszkópos megfigyelés szerinti konfluens állapot kialakulását követő napra tettük, ezeket használtuk fel B-típusú kísérleteinkhez. A CDM hígítása: A CDM-et szérummentes MEM-ben hígítottuk a kívánt mennyiségre, 1000-szeresen hígított törzsoldatból kiindulva. Az emulzió finom diszperzitását hosszas, intenzív kevertetéssel biztosítottuk Vortex mixer segítségével. Az adott higitású emulziókat a sejttenyészeteken való alkalmazás előtt újra gondosan homogenizáltuk. Sejtszám meghatározást Bürker-féle Bejtszámoló kamrában végeztünk, valamint a citofluorimetriás mérések esetén automatikusan a Cytofluorograph mérési értékeit fogadtuk el. Flow - mikrofluorimetriás mérések: A sejteket tripszinizálást követően centrifugáltuk, majd 50 Mg/rol propidium-jodidot tartalmazó izotóniás trinátrium-citrát-oldatban jég között 30 percig festettük. A sejtek mérését Cytofluorograph-ban végeztük (Bio/Physics Inc.) 488 nm-en működtetett Ar ion gázlézerrel. A propidium-jodid-DNS komplex fluoreszcenciáját 600 nm felett detektáltuk. A készülékbe épített elektronikus differenciál diszkriminátor segítségével nem vettük tekintetbe azokat a sejteket, melyek DNS tartalma a .diploid' DNS tartalomnál alacsonyabbat mu-25 30 35 40 45 50 55 60 65 , 6
