200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
9 HU 200093 B 10 t&tott, mivel ezen sejtek feltehetően már hosszú idővel a mérés megkezdése előtt elpusztultak. Viabilitás meghatározás; A sejteket tripszinizálás után 0,05% trypan kék festéket tartalmazó MEM-be tettük, és 5 perccel a festés megkezdése után fénymikroszkópban számoltuk az élő (a trypan kéket kizáró) és az elpusztult (megkékűlő) sejteket. Reverzibilitás meghatározás: A kiültetett sejteket 24 órán keresztül kezeltük CDM-mel. Ekkor a párhuzamosok egy részét eltávolitottuk, analizáltuk, mig más részét tovább növesztettük friss, CDM-met nem tartalmazó komplett médiumban. A sejteket további 24 óra elteltével eltávolitottuk és analizáltuk. EREDMÉNYEK, ÉRTÉKELÉS A CDM vizsgálatát először log-fázisban levő tenyészeteken végeztük. Széles higitási tartományban kerestük meg a további vizsgálatokhoz használható optimális dózistartományt SP2 sejtvonalon történt méréssel (1. ábra). Az itt szerzett tapasztalatok alapján az 5 x 10*-107-szeres higitási tartományban dolgoztunk a továbbiakban. A felvett növekedési görbék módosulásai alapján tesztrendszereink több csoportba sorolhatók:- a CDM 15 x lO^szeres hígításban a teszt 24. órájára elpusztítja a rendszer sejtjeit (K—562, MRC-5, BHK-B, McCoy, HAK; Sp2).- A CDM 15 x 104-szeres hígításban a rendszer sejtjeit a teszt 48. órájára pusztítja el (P-388, L-1210, BHK-Tüb).- Toxikus hatás a vizsgált tartományban nem tapasztalható (Heia, LLC). Ez utóbbi két sejtvonal esetében a CDM bizonyos koncentrációi a log-fázisú populációk sejtszaporodását serkentették. A CDM kontakt gátlás állapotában levő kultúrákra kifejtett hatását két szériában mértük. Ezek alapján megállapítható, hogy a CDM 105 feletti higitások alkalmazása esetén revertálható hatású, mig IQ4 alatti hígításokat alkalmazva gátlása irreverzibilisnek tűnik. A tenyészetek 72. órájában felvett dózis-hatás görbék alapján a görbék egy része folytonos lefutást mutat (BHK-B, BHK-Tüb., HAK, L-1210), mig más részük lokális minimum hellyel rendelkezik (SP2, McCoy, LLC, HeLa, MRC-5, P-388). A fenti lokális minimum helyek többsége a 105-106-szoros higitási tartományba esik. Viabilitás vizsgálatokat négy sejtvonalon végeztünk (LLC, McCoy, HeLa, BHK-Tüb) az 5 x ÍO^-IO® higitási tartományban. lO^szeres és ennél kisebb hígításokban a CDM 100%-os toxicitást mutat. Az in vitro mért LDso-érték a 104 és 5 x 104-szeres higitások közé esik. További in vitro kísérletekben leukémia vírust termelő QL transzformált sejtvonalat választottuk a CDM hatásának vizsgálatára. [Nagy, K.: Chester Beatty Seminars (London), 1983.] Az erősen lúgos kémhatású CDM anyagot nem közvetlenül adagoltuk, hanem először dimetil-szulfoxidban (DMSO, Reanal) oldottuk, majd ennek hígításait alkalmaztuk. Sejtkultúra: QL transzformált fürj-fibroblaszt sejtvonal (1. ábra), amely permanensen termeli a fokozottan onkogén MC29/L leukémiái virus variánst. A sejteket Falcon típusú műanyag tenyésztőedényekben tartottuk fenn, és szaporítottuk. Tápfolyadéknak 10% triptóz-foszfáttal, 5% fetal borjú szérummal, 1% csirke szérummal kiegészített Parker 199 médiumot használtunk. A tenyésztőedényeket 37 °C-on inkubáltuk 5% COz atmoszféra mellett. A sejtkultúrákat általában kétnaponként tripszinizálással passzáltuk. Sejtszám-meghatározás: A tenyésztőedényekben levő teljes sejtmennyiségből tripszinnel sejtszuszpenziót készítettünk, majd a sejtkoncentrációt Laborscal (Labor MIM) elektromos sejtszámlálóval, esetenként Buerker-kamrával határoztuk meg. Viabilitás: A sejtszám meghatározásánál csak a biológiailag ép, élő sejteket vettük figyelembe, ezek arányát a tripán-kék kiszorítás alapján állapítottuk meg. 3H-timidin beépülés meghatározása: A sejtek DNS szintézise intenzitásának megállapításához a sejtkultúrákhoz (106 sejt/edény) a CDM kezelést követően 50 yCi (0,2 ml) radioaktív timidin nukleozidot adtunk (Thymidine (6-3H, Chemopol., Csehszlovákia). A feltüntetett időpontokban a sejtszuszpenziót tápfolyadékban mostuk, és centrifugálás után (2000 rpra, 5 min., +4 °C) 5 ml hideg 5%-os triklór-ecetsavval precipitáltuk és Millipore filterre gyűjtöttük. A minták radioaktivitását scintillációs számlálóval (Packard Tricarb) mértük. Reverz transzkriptáz assay: A QL sejtek tápfolyadékában az MC 29/L virus jelenlétét és relatív titerét a csak az RNS tartalmú daganatvirusokra jellemző enzim aktivitásának mérésével határoztuk meg. A tápfolyadékot centrifugálással (10 000 g, 30 min, +4 °C) tisztítottuk meg a sejttőrmeléktól, majd a vírusokat ultracentrifugálással (100 000 g, 90 min, +4 °C) koncentráltuk (MSE 65 Super Speed, U.K.) Az üledéket 0,01 M Trisz-HCl pH = 7,5, 0,1 M NaCl és 0,001 M EDTA pufferben reszuszpendáltuk. A reakciót az Acta Microbiol. 25, 142 (1978) cikkében le-5 10 15 20 25 30 35 •10 45 50 55 60 65 7
