200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
4L HU 200093 B 42 A.I Free Radical Reactions in Medicine Springer-Verlag (1987). Ito N. és munkatársai, Fd. Chem. Toxic., 24, No 10/11. 1071-1082 (1986). Kensler W. T. és munkatársa, Adv. in Free Radical Biol, and Medicine, 2, 347-387. (1986). I. A CDM in vitro antioxidáns hatásénak vizsgálata A kísérletekhez 150-200 g-os patkányokat használtunk. A mikroszóma preparátumokat a dekapitált és kivéreztetett állatok máj homogenizátumaiból készítettük ultracentrifugálásos eljárással, Jordan és munkatársai [Bióchem. Pharmacol, 31, 1393-1400 (1982)] módszere szerint. Az enzimatikusan indukált lipid peroxidációt Jordan és munkatársai szerint (lásd előbb) mértük, Ottolanghi tiobarbitursavas malondialdehid meghatározását felhasználva [Ottolenghi, Arch. Biochem. Biophys., 79, 355-363. (1959)]. A fehérjét Gornall és munkatársai [J. Bioi. Chem., 177, 711-766. (1949)] metodikája szerint mérjük. Standardnak bovin szérum albumint használunk. A nem enzimatikusan indukált lipid peroxidációt aszkorbinsav jelenlétében patkány agy homogenizátumon mértük. A patkányokat dekapituláltuk és a teljes agyat eltávolítottuk, majd jeges hűtés mellett, 0,15 M-os KC1- -ben homogenizáltuk Potter-Elvenjen készülékben, Player és munkatársai [J. Neurochem., 37, 422-426. (1981)] szerint. A reakcióelegy: 0,05 M trisz-maleinát puffer (pH=6,8), 1,0 nM KH2PO4 és különböző koncentrációjú aszkorbinsav (IO-3, IO-4 M), 1 mg/ml fehérje. A rázatás reakcióideje 15 perc 37 °C-on. A malondialdehid meghatározás Ottolenghi (lásd fent) módszere szerint történt. A fehérje meghatározás Gornall (lásd fent) módszere szerint történt. A CDM hatását az indukált lipid peroxidációra az in vitro rendszerekben elóinkubálást követően vizsgáltuk. A mikroszóma preparátumokkal különböző mennyiségű CDM-et (160-1,6 praol/1) különböző ideig (10, 20 és 30 perc) elóinkubáltuk. Ezen elóinkubációt követően adtuk a rendszerekhez a NADPH-t illetve az aszkorbinsavat a megadott módszerek szerint, és még 15 percig folytattuk az inkubációt. Az adrenokrom átalakulást Sigma adrenalin készítmény enyhe melegítésekor kapott színreakció gátlásának (vörös szín eltűnése) időbeli követésével vizsgáltuk. A reakcióelegy 200 pM adrenalint és a CDM különböző (160-1,6 pmol/1) koncentrációt tartalmazta. A mérést neutrális pH-n végeztük. Értékelés:- A CDM gátolja a fény hatására adrenalinból képződő kromofor keletkezését (adrenalin-adrenalin ortokinon-adrenokrom-leuko-adrenokróm). A gátló hatás dózis depndensen csökken, de a vizsgált 160-1,6 pmol/1 koncentráció-tartományban észlelhető.- A CDM 160-16 pmol/1 koncentráció-tartományban gátolja (kontrolihoz képest 50%-os gátlás 16 pmol/1); 3 pmol/1 koncentrációban nem befolyásolja; 1,6 pmol/1 koncentrációban pedig serkenti a N'ADPH-t + Fe3*-sal enzimatikusan indukált lipid peroxidációt patkánymáj mikroszómán. A gátló hatások az előinkubáció időtartamának növekedésével arányosan növekednek.- A CDM 160-3 pmol/1 koncentrációban kifejezetten 3-1,6 pmol/1 koncentrációban gyengébben gátolja mind a spontán lipid peroxidációt, mind az aszkorbinsavval indukált lipid peroxidációt patkány agy homogenizátumon. Az indukálható lipid peroxidáció mértéke a CDM koncentrációjától és az elóinkubáció időtartamától függően változott. II. A CDM in vivo antioxidáns hatásának vizsgálata Kísérleteinket him Wistar patkányokon végeztük. A CDM-t 10 és 100 pg/kg napi dózisban 3 illetve 6 napig adtuk az állatoknak. A kontrollcsoport izotóniás NaCl-t kapott. Csoportonként 5-5 állaton két alkalommal végeztünk méréseket. Az állatokat a kezelés után dekapituláltuk és kivéreztettük, májukat eltávolitottuk, majd jeges hűtés mellett homogenizáltuk Potter-Elvenjen készülékben. A mikroszóma preparálást Jordan és munkatársai [Biochem. Pharmacol., 31, 1393 (1982)] módszere szerint végeztük. A lipid peroxidációért felelős enzimek aktivitását a malondialdehid-tartalom mérésével határoztuk meg Ottolenghi [Arch. Biochem. Biophys., 79, 355-363 (1959)] módszere szerint. A kezelt állatok májából izolált mikroszóma homogenizátumon indukáltuk in vitro NADPH + Fe,3-al a lipid peroxidációt az alábbi közegben: A reakcióelegy 20 mM Na-foszfát-puffert (pH = 7,5), 0,15 M KCl-ot, 50 pM FeCb-ot, 50 mM pirofoszfátot, 10 mM glükóz-6-foszfátot (Sigma, USA), 0,6 NE glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt (Sigma, USA), 0,5 mM NADPH-t (Sigma, USA) lmg/ml mikroszomális proteint tartalmazott 0,5 ml végtérfogatban. A méréseket 37 °C-on rázó fürdőben történő levegőztetéssel végeztük. A fehérjetartalmat Lowry és munkatársai [J. Bioi. Chem., 193, 265-275. (1951)] módszere szerint határoztuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 23
