200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
31 HU 200093 B 32 3. ) A CDM hatása az egér lépsejtek blasztos transzformációjára Anyagok és módszerek CBA/CA (LATI, Gödöllő) hím egereknek 20, 50 és 100 Mg/kg CDM-et adtunk intraperitoneálisan. Két óra múlva az állatokat leéltük. Lépeiket eltávolítottuk, a lépsejteket Fieoll-Uromiro gradiensen szeparáltuk, majd Greiner (NSZK) tenyésztőlemezeken 200 ezer sejtet tenyésztettünk 5-5 párhuzamost használva. Röviden: az RPMI 1640 tápfolyadék (GIBCO, USA) 10% hővel inaktivált fetális borjúsavót (Phylaxia, Budapest), 2 mM L-glutamint (SERVA, NSZK), 100 NE Penicillint, 100 Mg/ml gentamycint és 7,5 Mg/ml amphotericin B-t (SIGMA, USA) tartalmazott. A mitogének koncentrációja: fitohemagglutinin (PHA, Leucoagglutinin, Pharmacia, Svédország) 1, ill. 10 Mg/ml, Concavalin A (Con A, Pharmacia, Svédország), 1, 5 ill. 10 Mg/ml pokeweed mitogen (PWM, Sigma, USA), 10 jug/ml. A mintákat 37 °C-on 72 órán át inkubáltuk 5% COz-t tartalmazó atmoszférában. Nyolc órával a leállítás előtt 0,4 uCi 3H-timidint (UVVVR, Csehszlovákia) adtunk a tenyészetekhez. A fagyasztással leállított mintákat Dynatech (NSZK) automata készülékkel dolgoztuk fel, a radioaktivitást szcintillációs számlálóban határoztuk meg, és c.p.m.-ben adtuk meg. A CDM hatása egér lépsejtek blasztosodására A CDM önmagában és raitogénekkel együtt dózis dependensen fokozta a spontán timidin inkorporációt. A maximális hatást a 20 és 50 Mg/kg dózisú CDM adásával értük el. Ezen dózisok alkalmazását követően a timidin inkorporáció átlagosan a kétszeresére növekedett. Különösen kifejezett volt a hatás, ha szuboptimális dózisú (1 Mg/ml) Con-A-val stimuláltuk a sejteket. A vizsgálatok jól egyeznek a Winn assay (lásd előbb) során kapott eredményekkel, melyek szerint a CDM-mel előkezelt állatok lépsejtjeinek fokozódik a tumorgátló hatása. Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21, 97. (1968), Láng, I. és munkatársai, Scand. J. Immunoi., 13, 361. (1981), Onody, C. és munkatársai, Thymus, 1, 205. (1980), Láng, I. és. munkatársai, Scand. J. Immunoi., 14, 573. (1981), Waldmann, T. A. és munkatársa, Adv. Immunoi., 32, 1. (1983). 4. ) A CDM fagocitózis fokozó hatása A szervezet daganat elleni küzdelmében a makrofágok igen jelentős szerepet játszanak. Minél nagyobb a makrofág aktivitás mértéke, annál sikeresebb a szervezet védekezőképessége a tumorokkal szemben. In vitro kísérletek azt igazolják, hogy az aktivált makrofágok képesek elpusztítani a tumorsejteket. Martin, D. E. és munkatársai, Cancer Invest., 2 (5), 339-345. (1984), Raynor, R. és munkatársai, Oncology, 41, 420-426. (1984). Módszerek: Fagocitás vizsgálata NBT-redukcióval: A vizsgálati módszer lényege az, hogy a fagocitózis során a makrofágokba bekebelezett anyagok az oxidativ anyagcsere fokozása útján szuperoxid-aníon-képződést indukálnak, amely a tétrazolium (NBT: nitroblue-tetrazolium) festéket formozánná redukálja. A redukció színváltozással jár, Így a fagocitózis mértéke spektrofotometriásán meghatározható, és az 520 nm-nél mért extinkció értékével jellemezhető. Ferdinandy, K., Orvosi hetilap, 122, 46., 2825-2831. (1981). A redukció kivitelezése: 300 m1 sejtszuszpenzióhoz 100 m1 szérumot és 100 jul 2 nM-os NBT-oldatot adunk. Az elegyet 1 órán át inkubáljuk 37 °C-on. Néhány m1 szuszpenzióból kenetet készítünk viabilités vizsgálathoz, majd a redukciót 100 m1 0,1 n HCl-oldattal leállítjuk. A sejteket háromszor mossuk Na-foszfát-puff errai, majd a sejtekből kivonjuk a formazánt 2 ml dioxánnal, 70 °C-os vízfürdőn. A szuszpenziót centrifugáljuk, és a szupernatáns extinkcióját 520 nm-en megmérjük. A CDM HATÁSA A SEJTMEMBRÁNRA A daganatsejtek egyik jellemző sajátossága a heterogenitás, ez megnyilvánul abban, hogy a tumorok mind genotípusosan, mind fenotipusosan különböző populációkból állnak. A fenotipusos különbségek közül legjellemzőbb a daganatsejtekre a sejtfelszíni őszszetevők variabilitása. Ez azáltal válik lehetővé, hogy a sejtmembránban levő cukor polimerek szerkezetükből adódóan igen nagy strukturális különbözőségi potenciállal rendelkeznek. A leginkább vizsgált, s jellegzetes változások a különböző daganatsejtek sejtfelszíni paraméterei közül a glükoproteinek, a glükolipidek, és a glükózamino-glikánok (ezen molekulastruktúrákba tartoznak a különböző antigének is). A sejtfelszin mintegy .kapcsoló organellumnak ' tekinthető, mely biztosítja a kölcsönhatást a mikrokörnyezettel. A sejtfelszíni cukorpolimereknek elsődleges szerepe van a sejtek közötti felismerési folyamatokban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
