200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
In vivo vizsgálatok között változtattuk nagyságrendes hígítással. A kolóniák számát, illetve azok differenciáltíj Ehrlich ascites tumorsejtek: ságát a szélesztést követő hatodik napon határoztuk meg. Vizsgáltuk a sejtek egy speci-27 HU 200093 B 28 CDM-mel kezelt és kezeletlen (kontroll) 5 egerekből nyert Ehrlich ascites tumorsejtek felszínén található fibronektin (FN) mennyiségének a vizsgálata: Módszer: 10 A CDM kezelés 500 jug/kg dózisú COM intraperitoneális adagolásával történt 1 hétig, naponta. A kontroliegerek a CDM-mel azonos mennyiségű fiziológiás só-oldatot kaptak. Me- 15 tanoUal tárgylemezre fixált tumorsejteket primer antitestként 1:100 higitású, nyúlban termeltetett anti FN immunglobulinnal inku- báltuk egy éjszakán át, majd a mintákat Na-foszfát-puffert tartalmazó, fiziológiás só- 20-oldattal többször átmostuk. Szekunder antitestként 1:100 higitású, peroxidázzal jelzett anti-nyúl immunglobulint kötünk a primer antitestre. A peroxidáz reakció elóhivása di- amino-benzidin-tetrahidro-kloriddal történt. 25 A reakció előhívása után a sejtek felszínén található FN mennyiséget fénymikroszkóppal vizsgáltuk. Eredmény: 30 A CDM kezelést követően nyert Ehrlich ascites tumorsejtek felszínén 2-3-szor vastagabb FN réteg képződött a kezeletlen kontrollokhoz viszonyítva. 35 2) Limfocitás choriomeningitis vírusfertőzés A CDM hatása a limfocitás choriomeningitis vírusfertőzés lefolyására egerekben. 40 Felnőtt egerekben a vírusfertőzést követő meningitis lefolyását nem befolyásolja. Ezzel szemben szopós egerek T-dependens immunológiai reakcióját fokozza, mely az ontogenetikai fejlődés gyorsítását jelenti (immunológiai 45 érés, differenciálódás).- Részletesen lásd később, az immunológiai vizsgálatoknál. A differenciálódási folyamat irányának a SO befolyásolása: Módszerek: A mielocitás leukémiából származó egér 55 csontvelő sejtek differenciálódásának in vitro rendszerben történő vizsgálatát lóvérből nyert ún. .plasma cloth'-on végeztük, McCoy médiumban, 20% plazma jelenlétében. (Főtten, C. S., Stem. Cells. Chureil Liwington, London 60 (1983)]. Petri-csészénként egyenlő számú primer sejtet szélesztve (500 sejt/ml) vizsgáltuk a kolóniaképződésre gyakorolt CDM hatást. A CDM-et 0,05-15 umol/1 koncentráció-határok 65 fikus induktor (WEHI) hozzáadását kővető differenciálódásának jellegét és mértékét a CDM különböző koncentrációinál. Az inkubálási időt követően kialakuló kolóniákból a sejtek leukocitákká illetve monocita makrofággá differenciálódnak. Eredmények Minimálisan bipotencialitásukat megőrzött csontvelősejtek kolóniáinak differenciálódásakor a CDM kezelés hatására eltolódás tapasztalható a keletkező sejttípusok arányában. Mig a kontroll esetében nagyobb arányban mielociták, addig a kezelt kultúrákban nagyobb mennyiségben monocita makrofág jellegű sejtek jelennek meg. A CDM maximális hatását 5 jumol/1 koncentrációban észleltük. A hatás jelentősége A CDM differenciálódást elősegítő hatása feltételezésünk szerint a következő biokémiai mechanizmusokkal magyarázható:- A CDM gátolja a foszfatidil - inozitol - monofoszfát (PIPi) bifoszfáttá (PIP2) való átalakulását.- A CDM szelektív kalmodulin antagonists.- A CDM protein kináz C gátló. Ezen biokémiai folyamatok gátlása nem vezet a sejtek pusztulásához, hanem lehetővé válik, hogy a sejtek kikerüljenek az állandó osztódási ciklusból, és a differenciálódás irányába álljanak át a sejtanyagcsere folyamatok. A tetanusz toxin adása: Az immunizálástól számított 21. napon kellő mennyiségű LDso-tartalmú tetanusz toxinnal mérgezve a kísérleti állatokat, megfigyeltük a csoportokban bekövetkező túlélési/ elhullási arányokat. Kaerber-Spearman módszerével meghatároztuk az 50%-os védettséget okozó antigénmennyiségeket csoportonként, majd azok értékét a kontroll standardokhoz viszonyítva relatív hatásfokban fejeztük ki. Eredmények:- az adszorbeált tetanusz toxoid csökkenő adagjaival immunizált kísérleti állatok tetanusz toxinnal szembeni védettségének mértékét a CDM adagtól és az alkalmazásnak a teszt-antigénhez viszonyított időzítésének a függvényében befolyásolja.- A CDM optimális adagolás (100-150 jug/kg) esetébi-n a leghatásosabb .ad-16
