199900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív, LL-F 28249 jelű új anyagok és hatóanyagént ezeket tartalmazó állatgyógyászati készítmények előállítására,továbbá hatóanyagként a fenti anyagokat tartalmazó nematocid,inszekticid és akaricid készítmények
1 HU 1999(H) B 2 ledesztilláljuk, lerc-butanolt adunk hozzá és az elegyct liofilizáljuk. 60 mg LL-F28249a-t kapunk, amelynek fizikai állandóit a leírás első részében ismertetjük. A 40 - 43. frakciókat egyesítjük, a metanolt ledesztilláljuk és a maradék vizes szuszpenziót metilén-kloriddal extraháljuk. Az extrpVtumot bepárolva 10 mg tiszta LL—F28249/M tápunk, amelynek Fizikai állandóit a leírás első részében ismertetjük. Az 1,08 g, LL — F28249-Y-t tartalmazó olajat 10% etii-acetátot tartalmazó metilén-kioridban oldjuk és szilikagéllel töltött oszlopra (2,5x50 cm) visszük. Az eluálást 10% etil-acetátot tartalmazó metanollal végezzük, 3 ml/perc átfolyási sebességgel, és 12 perces frakciókat gyűjtünk. A 19-29. frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A maradékot fordított fázisú preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, az ő és O komponensek esetén ismertetett módon. Az 55 — 62. frakciókat egyesítjük, a metanolt vákuumban elpárologtatjuk, terc-butanolt adunk a maradékhoz, és az elegyet liofilizáljuk. 60 mg tiszta LL - F28246'H kapunk, amelynek fizikai állandóit a leírás első részében ismertetjük. 4. példa Üzemi méretű fermentálás A Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL 15773 törzsből az 1. példában leírtak szerint inokulumot készítünk, 100 ml primer inokulummal 10 1 szekunder inokulumot állítunk elő. A fermentálást két 300 1-es fermentorban végezzük, a 2. példában leírtak szerint. A 300 1 fermentációs tápközeget 10 1 szekunder inokulummal oltjuk be. A fermentálást 118 órán át folytatjuk, majd a teljes fermentációs biomasszát összegyűjtjük. 5. példa LL — F28249w antibiotikum izolálása A 4. példában leírt módon előállított, összesen 450 1 térfogatú összegyűjtött fermentációs biomasszát a 3. példa első részében leírt módon kezelve állítjuk elő a szirup formájú nyersterméket. A kapott szirupos maradékot hexánnal mosva eltávolítjuk a nem-poláros anyagokat, és a visszamaradó 9 g oldhatatlan anyagot Sephadex LH— 20 oszlopon megoszlási kromatográfiának vetjük alá. 9 g Sephadex LH - 20-at metanolban duzzasztunk, majd 10x110 cm-es oszlopot készítünk belőle. Az oszlopot 4800 ml mozgó fázis (metilén-klorid, hexán és metanol 10:10:1 arányú elegye) 5 ml/perc sebességű át folyatásával ekvilibrátjuk. A 9 g oldhatatlan anyagot 50 ml mozgó fázissal visszük fel az oszlopra. 5 ml/perc átfolyási sebesség mellett 2150 ml előeluátumot gyűjtünk. Az átfolyási sebességet ezután 8 ml/percre növeljük, és 45 perces frakciókat szedünk. A 9 —12. frakciókat egyesítjük és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. 4,9 g maradékot kapunk. A maradékot ciklohexán és etil-acetát 1:1 arányú elegyében oldjuk, majd lassan hagyjuk bepárolódni, szobahőmérsékleten. n-Hexán hozzáadásával csapadékot kapunk, melyet összegyűjtünk. 3,1 g szilárd anyagot kapunk. A fenti szilárd anyag 3,0 g-ját 25 ml metilénkloridból 50 ml n-hexánnal kicsapva tovább tisztítjuk. A kapott csapadékot 15 ml metilén-kioridban újra feloldjuk, és 25 ml n-hexánnal újra kicsapjuk. 510 mg tiszta LL-F28249w-t kapunk, amelynek fizikai állandóit a leírás első részében ismertetjük. 6. példa LL-F28249Æ, c, c, ti, e és t izolálása Az 5. példa szerinti Sephadex LH —20 oszlopon kapott 4 — 7. frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. 1,9 g maradékot kapunk. A fenti maradékot 200 g szilikagéllel töltött oszlopon (2,5x83 cm) kromatografáljuk, az eluálást 10% etil-acetátot tartalmazó metilén-kloriddal végezzük. Az átfolyási sebesség közel 2 ml/perc, és a frakciókat 12 percenként szedjük. A 65-67. frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. 250 mg maradékot kapunk. A fenti 250 mg maradékot a 3. példában leírtak szerint fordított fázisó preparatív kromatográfiás eljárással tisztítjuk, azzal az eltéréssel, hogy mozgó fázisként 75%-os vizes metanololdatot használunk. Az átfolyási sebesség közel 10 ml/perc. Az első 2000 ml eluátumot elöntjük, majd két percenként 72 frakciót szedünk. Újabb 300 — 400 ml eluátumot elöntünk, majd 2,5 percenként szedünk frakciókat. A frakciókat az alábbi táblázat szerint egyesítjük. Az egyesített frakciókat elszívófülke alatt egy éjszakán át hagyjuk bepárolódni, majd a komponenseket metilén-kloriddal extraháljuk. Az oldószer elpárologtatása után minden egyes komponensből közel 1 mg tiszta anyagot kapunk, amelyek fizikai állandóit a leírás első részében ismertetjük. Egyesített frakciók Komponens 7-10. LL-F28249« 19-22. LL—F28249« 28-31. LL—F28249f 81-83. LL—F28249i> 86-88. LL—F282490 93 - 95. LL — F28249t 7. példa LL-F28249k, A, m és v izolálása A 2. példa szerint előállított fermentléből nyert összesen 390 1 összegyűjtött fermentáció biomasszát a 3. példa első bekezdésében leírtak szerint feldolgozva 120 ml metilén-kloridos koncentrátumot kapunk. A koncentrátumot 200 ml hexánnal hígítjuk, és egy éjszakán át 4 X-on tartjuk. A kapott csapadékot szűréssel eltávolítjuk és eldobjuk. A szűrletet 300 ml hexánnal hígítjuk. A kapott csapadékot (A) szűréssel összegyűjtjük, és eltesszük. A szűr letet szárazra párol-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
