199900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív, LL-F 28249 jelű új anyagok és hatóanyagént ezeket tartalmazó állatgyógyászati készítmények előállítására,továbbá hatóanyagként a fenti anyagokat tartalmazó nematocid,inszekticid és akaricid készítmények
1 HU 199900 B 2 juk és az olajos maradékot 200 ml metilén-kloridban oldjuk, majd 1700 ml hexánnal hígítjuk. A kapott csapadékot (B) szűréssel összegyűjtjük és eltesszük. A szűrletet olajos maradékká koncentráljuk, majd 50 ml metilén-kloridban oldjuk, és 950 ml metanolt adunk hozzá. Az oldatot 4 °C- on 3 napon át állni hagyjuk. A kivált csapadékot leszűrjük és eldobjuk. A szűrletet szárazra pároljuk és a maradékot (C) az (A) és (B) csapadékkal egyesítjük, majd 5,0 x 109 cm-es, etil-acetát és metilén-klorid 1:9 arányú elegyében szuszpendált Woelm TSC szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot a fenti összetételű oldószerelegygyel eluáljuk, 25 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Az első 2 1 eluátumot elöntjük, majd tizenhat 400 ml-es frakciót szedünk. A 2. és 3. frakciót egyesítjük, és bepároljuk. 3,9 g olajos anyagot (D) kapunk. A 4—7. frakciókat egyesítjük és bepároljuk, 9.5 g olajos anyagot kapunk, melyet hexánban oldunk és etil-acetát és hexán 1:4 arányú elegyében szuszpendált 300 g Woelm szilikagéllel töltött 2.5 x 110 cm-es oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást is a fenti összetételű oldószereleggyel végezzük, 4 ml/perc átfolyási sebesség mellett, a frakciókat 7 perces időközökben szedjük. A 45 — 54. frakciókat egyesítjük és bepároljuk, 0,3 g anyagot (E) kapunk. A 63-135. frakciókat egyesítjük, szárazra bepároljuk, terc-butanolban újraoldjuk és liofilizáljuk, 4,6 g piszkos-fehér szilárd anyagot (F) kapunk. LL — F28249/C és u A (D) és (E) anyagot egyesítjük, és 2,5 x 110 cm-es, 300 g Woelm szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk, az eluálást etil-acetát és hexán 1:9 arányú elegyével végezzük. Az átfolyási sebességet 4 ml/perc értéken tartva 7 perces időközökben szedjük a frakciókat. A 67 — 115. frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk, 920 mg (G) maradékot kapunk. A fenti (G) maradékot preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, fordított fázisú (Whatman C8, 2,2 x 50 cmes) oszlopot használva, az eluálást 85 térfogat%os vizes metanolloldattal végezzük. Az átfolyási sebesség közel 10 ml/perc, és a frakciókat 2,5 perces időközönként szedjük. A 33-40. frakciókat egyesítjük, és a metanolt eitávolítva koncentráljuk. A maradékot metilénkloriddal extraháljuk. A bepárlással kapott maradékot terc-butanolban oldjuk és liofilizáljuk. 60 mg LL-F28249ic-t kapunk, amelynek fizikai állandóit a leírás első részében ismertetjük. Az 52-58. frakciókat hasonlóképpen feldolgozva kis mennyiségű LL-F28249p-t kapunk, amelynek fizikai állandóit a leírás első részében ismertetjük. LL-F28249A Az (F) anyag 1 g-ját fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, a fent ismertetett módon, azzal az eltéréssel, hogy az eluálást é80 térfogat%-os vizes metanololdattal végezzük. A 61—75. frakciókat egyesítve és a fentiek szerint feldolgozva 100 mg LL-F28249A-t kapunk, amelynek fizikai állandóit a leírás első részében ismertetjük. LL-F28249./ 396 g (D) anyagot 500 ml metanolban oldunk, majd néhány órán át 4 °C-on tartjuk. A kivált csapadékot leszűrjük, hideg metanollal mossuk, majd eldobjuk. Az egyesített szűrletet és mosófolyadékot bepároljuk. A maradékként kapott olajos anyagot hexánban oldjuk, és 5x50 cm-es, száraz szilikagéllel (Mallinkrodt SilicAR cc—7) töltött oszlopra visszük. Az oszlopot etil-acetát és hexán 1,5:8,5 térfogatarányú elegyével eluáljuk, az átfolyási sebesség 50 mi/perc körül van. Négy frakciót gyűjtünk, az alábbiak szerint: Frakcó Térfogata (liter) 1. 1 2. 4 3. 1 4. 2 A 3. frakciót bepárolva 5,0 g maradékot kapunk, melyet preparatív, fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (Waters Cig, 5x60 cm) tisztítunk. Az oszlopot először 16 1 80 térfogat%-os vizes metanololdattal eluáljuk, 100 ml/perc átfolyási sebesség mellett, majd 6,4 l 84 térfogat%-os vizes metanololdattal. Az első liter eluátumot elöntjük, majd 400 ml-es frakciókat szedünk. A 44 - 47. frakciókat egyesítve és a fentiek szerint feldolgozva 390 mg LL — F28249i/-t kapunk, halványsárga szilárd anyag formájában, amelynek fizikai állandóit a leírás első részében ismertetjük. 8. példa Az LL - F28249 jelű vegyületek fonalféreg elleni aktivitása A fermentációs tápközeg nematoda-ellenes aktivitását in vitro vizsgáljuk, teszt-organizmusként a vadonélő Caenorhabditis elegáns (C. elegáns) fonalférget használva. A vizsgálatot úgy végezzük, hogy 96 lyukú mikrotitrátor lemez minden egyes lyukába 50 /d tápközeget pipettá-zunk, és hozzáadunk 10 pl három vagy négy napos C. elegáns tenyészetet (amelynek egyedei különböző fejlődési szakaszokban vannak) C. Briggsae-t fenntartó táptalajban (C. briggsae Maintance Medium) szuszpendálva. A fermentációs táptalaj hatását a táptalaj és a nematoda összekeverése után 48 órával jegyezzük fel. A 2. példa szerint előállított LL—F28249 fermentációs táptalaj az összes kifejlett férget megöli, és jelentősen csökkenti a különféle lárvaállapotokbag lévő férgek túlélését és mozgékonyságát, mind az eredeti, mind megismételt vizsgálatban. 9. példa LL-F28249 jelű vegyületek bélféreg-ellcnes hatása in vivo A vizsgálatot olyan in vivo rendszerben végezzük, mely alkalmas a C. elegáns ellen nematodaellenes hatást mutató különféle fermentációs 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
