199900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív, LL-F 28249 jelű új anyagok és hatóanyagént ezeket tartalmazó állatgyógyászati készítmények előállítására,továbbá hatóanyagként a fenti anyagokat tartalmazó nematocid,inszekticid és akaricid készítmények
1 HU 199900 B 2 ganizmus élő tenyészetót a Patent Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U.S. Patent Department of Agriculture, (Peoria, Illinois 61604, Amerikai Egyesült Államok) törzsgyűjteményében is letétbe helyeztük. A törzs a fenti helyen szabadon hozzáférhető bárki számára, letéti száma NRRL 15773. A fenti vegyületek előállítását nem korlátozzuk a fenti mikroorganizmussal végzett fermentációra. A fenti törzs természetes mutánsai, valamint a különféle mutagén szerekkel — például nitrogén-mustárral, röntgen-besugárzással, ultraibolya besugárzással, N’-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidinncl, aktinofágokkal vagy egyéb hasonló szerekkel — ismert módon, mesterségesen előállított mutánsok segítségével is előállíthatók a fenti új vegyületek, a találmány szerinti eljárás értelmében. Fermentálási körülmények A Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL 15773 törzs tenyésztését különféle cseppfolyós tápközegekben végezhetjük. Az LL-F28249 <v ß' T í> ç ij* 0> »• *> A* /*» v és u> jelű vegyületek termelésére alkalmas tápközegek egy hasznosítható szénforrást — például dextrint, szaccharózt, melaszt, glicerint stb. —, hasznosítható nitrogénforrást — például proteint, protein-hidrolizátumot, polipeptideket, aminosavakat, kukoricalekv'árt stb. — és szervetlen anionokat és kationokat — például kálium-, nátrium-, ammonium-, kalcium-, szulfát-, karbonát-, foszfát-, klorid-iont stb. — tartalmaznak. A nyomelemek - például bór, molibdén, réz stb. — a táptalaj egyéb összetevőinek szennyeződéseként van jelen. A levegőztetést a tartályban vagy üvegben úgy oldjuk meg, hogy a fermentációs táptalajba vagy annak felületére steril levegőt vezetünk. A tartályokban a további keverést mechanikus keverővei biztosítjuk. Kívánt esetben habzásgátló szert — például szilikonolajat — is adhatunk a fermentorba. 1 1. példa Inokulum előállítása Az alábbi összetételű táptalajt használjuk a különböző, primer és szekunder inokulumok > leállítására: dextróz 1,0% dextrin 2,0% élesztőkivonat 0,5% NZ-amin 0,5% kalcium-karbonát 0,1% víz 100,0%-ra A fenti összetételű táptalajt sterilezzük. A táptalaj 100 ml-ét — lombikban - leoltjuk a Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL 15773 ferde agar tenyészetéről vett micéliumokkal. A táptalajt 28 °C-on 48 - 72 órán át rotációs rázón rázatjuk. A kapott primer inokuluramal leoltjuk a fenti táptalaj 1 literét, majd a mikroorganizmust 28 °C-on aerob körülmények között 48 órán át tenyésztve előállítóik a szekunder inokulumot. 2. példa Fermentálás A fermentálást az alábbi összetételű táptalajban végezzük: dextrin 1,0% szója pepton 1,0% melasz 2,0% kalcium-karbonát 0,1% víz 100,0%-ra A fenti táptalajt sterilezzük, majd 30 1 fenti táptalajt leoltunk 1 liter 1. példa szerint előállított szekunder inokulummal. A fermentálást 30 *C-on végezzük, 301/perc steril levegő átvezetéssel, 5,51 x 104 Pa túlnyomással, 500 fordulatéperc sebességű keverés mellett, 91 órán át, majd a teljes fermentációs biomasszát összegyűjtjük. 3. példa LL - F28249o, ß és t jelű vegyületek izolálása A 2. példa szerint előállított, összesen 261 térfogatú összegyűjtött fermentációs biomasszát 1500 g diatomafölddel keverjük, majd szűrjük. A micélium-pogácsát 51 vízzel mossuk, és a szűrletet és a mosófolyadékot elöntjük. Á micéliumpogácsát 10 I metanollal egy órán át keverjük, majd szűrjük, és 5 I metanollal mossuk. A métanolos extraktumot és a metanolos mosófolyadékokat egyesítjük, és közel 1 — 21 térfogatra bepároljuk. A kapott vizes maradékot két térfogatnyi metilén-kloriddal hígítjuk, és 0,5 órán át keverjük. A metilén-kloridos fázist elválasztjuk, majd sziruppá koncentráljuk. 27 g nyersterméket kapunk. A kapott 27 g nyersterméket metilén-klorid és metanol elegyében feloldjuk, gyapoton és vízmentes nátrium-szulfáton átszűrjük, majd bepároljuk. 7,0 g olajat kapunk. 170 szilikagélt 12,5% etil-acetátot tartalmazó metiién-kloridban oldjuk, majd az oszlopra viszszük. Az eluálást a fenti Összetételű oldószereleggyel végezzük. A mozgó fázis kezdeti sebessége 1,3 ml/perc, és 15 perces frakciókat gyűjtünk. 10 frakció után az átfolyási sebesség közel 0,5 ml/perc-re csökken, ezért az 1 —10. frakciók térfogata 20 ml-ről egységesen közel 10 ml-re csökken, és a 11 — 98. frakciók térfogata közel 7 ml. A 99. frakció szedésekor az átfolyási sebességet növeljük, így 10 perc alatt 25 ml-es frakciókat szedünk. Összesen 105 frakciót gyűjtünk. A kapott frakciókat vékonyréteg-kromatográfiásan vizsgáljuk, a futtatást etil-acetát —metilén-klorid 1:1 arányú elegyével végezzük. A 30 - 54. frakciókat egyesítjük és bepároljuk, 1,08 g LL - F282497-t tartalmazó olajat kapunk. Az 55 — 62. frakciókat egyesítjük és bepároljuk, 150 mg LL — F28249o-t és ß-l tartalmazó szilárd anyagot kapunk. A 150 mg LL - F28249a és ß antibiotikumot tartalmazó szilárd anyagot préparai ív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, fordított fázisú oszlopon (Whatman C8, 2,2 x 50 cm), az eluálást 80 térfogad metanolt tartalmazó vízzel végezzük. Az átfolyási sebesség 10 ml/perc, 2 perces frakciókat gyűjtünk. Az 58 — 69. frakciókat egyesítjük, a metanolt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
