199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 Szilikonozott üveg küvettában a vizsgálandó frakció 175 /*l-ét, illetve a kontroll TBS 175 /»1-ét 50 /<l PFP-vel és 25 pl hígított BTP-vel rázzuk (900 ford/pcrc); 3 perc inkubációs idő után (37 *C-on) a koaguláció kiváltása 80 mM NaCl, 20 mM CaClj és 10 mM triszxHCl tartalmú puffer (pH * 7,5) hozzáadásával történik. A fibrin képződést egy "Payton Dual Aggregation Module" (G. Hornstra, Phil. Trans. R. Soc. London B, 294, 355-371, /1981/j használatával regisztráljuk. A kontroll alvadási ideje 65 másodpercet tesz ki. Ezt a vizsgálatot használjuk a tisztítás folyamán a különböző frakciókban lévő VÁC aktivitás meghatározására. A tisztítás folyamán a VÁC kitermelés meghatározásánál egy egység VAC-aktivitásnak az a VÁC mennyiség felel meg, amely a fent említett vizsgálatban az alvadási időt 100 másodpercre hosszabbítja meg. Egyes esetekben a BTP-t tisztított marha trombinnal vagy tisztított marha Xa faktorral helyettesítettük. Ebben a fél-tisztaságú alvadási rendszerben a trombin vagy a Xa faktor mennyiségét úgy választottuk meg, hogy a kontroll alvadási ideje ugyancsak 65 másodperc legyen. A trombin képződés vizsgálatát a következőképpen végezzük: Műanyag küvettában lévő 181 /ti TBSA-hoz hozzáadunk 20 /ti tisztított marha Xa faktort (150 mM), 30 /d PS/PC-foszfolipid membránt, 30 /d CaCl2-t (100 mM), 30 pl tisztított VAC-t (a végső koncentrációk adatait az ábrák magyarázata tartalmazza). A keveréket 37 °C-on 3 percig teflon keverővei keverjük. A trombin képződést 9 /ti tisztított marha II faktorral (33,33 /»M) váltjuk ki. Különböző idő elteltével 50 /d-es próbákat veszünk ki a reakció keverékből és ezeket olyan 1 ml-es műanyag küvettába visszük át, amelyet termosztáttal 37 °C-on tartunk, és amely 900 /ti TBSE-t és 50 /ti S 2238 kromogén szugsztrátumot (5 mM) tartalmaz. Az extinkciós érték változását 405 nm-en, Kontron Uvikon 810 spektrofotométerben mérjük és a reakciókeverékben lévő trombin mennyiségét standard görbe segítségével ezt marha trombin ismert mennyiségével vesszük fel — határozzuk meg. A VÁC állal előidézett gátlás százalékos arányát a következőképpen definiáljuk: gátlás %-ban = (1-a/b) x 100, ahol "a" a trombin képződés sebessége VÁC jelenlétében, II8 nM/perc-ben és ”b" a trombin képződés sebessége VÁC távollétében IIa nM/perc-ben. Proteinek A K vitamin függő faktorokat, a protrombint és a Xa faktort citrátos marha-plazma tisztításával kapjuk meg [J. Steflo, J. Biol. Chem., 251, 355 — 363 (1976)}. Bárium-citrátos adszorpció, elució, ammónium-szulfátos frakcionálás és DEAE-Sephadexen való kromatografálás két {»rőtéin frakciót eredményez, egy protrombin-IX aktor keveréket, illetve a X faktor keveréket, illetve a X faktort. A X faktort Fujikawa és munkatársai módszerével [Biochemistry, U, 4882- -4891. (1972)1 izoláljuk és RVV-X használatával [Fujikawa és munkatársai, Biochemistry, U, 4892-4899 (1972)] aktiváljuk. A protrombint a IX faktortól heparin-agaróz-affinitás kromatográfiával (Fujikawa és munkatársai, Biochemistry, 12, 4938 — 4945 (1973)] választjuk el. A heparin-agróz oszlopról leszedett protrombin tartalmú frakciókat egyesítjük és a továbbiakban Owens és munkatársai [J. Bioi. Chem., 249. 594-— 605. (1974)] módszere szerint tisztítjuk. A protrombin és a Xa faktoi koncentrációját Rosing és munkatársai [J. Bioi. Chem. 255. 274-— 283 (1980)] módszerével határozzuk meg. A BTP-t rutin eljárással állítjuk elő, Van Dam Mieras és munkatársai ("Blood Coagulation Enzymes, Methods of Enzymatic Analysis" Verlag Chemie GmbH, Weinheim) leírása szerint. A protein koncentrációkat Lowry és munkatársai módszerével [J. Bioi. Chem., 193. 265 (1951)] határozzuk meg. Foszfolipid, foszfolipid-vezikula és foszfolipid-liposzóma előállítása Az l,2-dioleil-sn-glicero-3-foszfokolin [l8:lcjs/18:lcigPC] és az l,2-dioleil-sn-glicero-3- foszfoszerin 118: Icjs/lSilcjs— PS] előállítását Rosing és munkatársai leírása szerint végezzük: PC-ből és PS-ből álló két külön gyártási tétel foszfolipidvezikulát állítunk elő ultrahang segítségével Rosing és munkatársai leírása szerint (lásd az idézett közleményben). Foszfolipid-liposzómában úgy állítunk elő reagens-oldatot, hogy kloroformban feloldjuk a szükséges menynyiségű foszfolipidet, a kloroformot nitrogén mellett pároljuk el. A visszamaradó foszfolipidet 5% glicerint tartalmazó TBS-ben szuszpendáljuk, 3 percig óvatosan keverjük üveggolyókkal, majd 10 percig 10.000 g mellett centrifugáljuk. A felülúszó oldatot eldobjuk, az üledékei újra óvatosan 5% glicerin tartalmú TBS-ben szuszpendáljuk; ily módon kapjuk meg a foszfolipidliposzóma-reagens oldatot. A liposzómákat szobahőmérsékleten tartjuk el. A foszfolipid koncentrációkat Böttcher és munkatársai [Anal. Chim. Acta, 24, 203 — 207. ) 1961)] szerint, foszfát-analízissel határozzuk meg. SDS — PAGE A gél-elektroforézist lemezeken végezzük SDS jelenlétében, Laemmli [Nature, 227, 680- -685. (1970)] módszere szerint. A gél 10% akril-amidot, 0,27% N,N3-bisz-akrilamidot és 0,1% SDS-t tartalmaz. A gép-próbák diszulfid-hidakat tartalmazó béta-merkapto-etanolból 5%-ot tartalmaznak. A géleket a következőképpen festjük meg: 1) 50% etanolt és 15% ecetsavat tartalmazó oldatban feloldott 0,25% Coomassie Blue R —250-el; a szintelenítés 10% etanolt és 10% ecetsavat tartalmazó oldattal történik; 2) Schiff reagenssel, amelyet bázikus fukszinnal (Mérek) állítunk elő Segrest és munkatársai ("Methods in Enzymology" (1972) 28. kötetének 54-63. oldalai) módszere szerint, vagy 3) ezüsttel, Merril és munkatársai [Electrophoresis, 3,17 — 23. /1982/] leírása szerint. (A fenti százalékok tömegszázalékot jelentenek!) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
