199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 Elektrofókuszálás A proteinek izoelektromos pH-jának meghatározásához kész vékonyréteg-poliakrilamid-géleket használunk, ezek Ampholine hordozó Ampholyte tartalmúak (LKB féle PAG-lemezek) 3,5-9,5 pH tartományban, s az eljárást a gyártó utasítása szerint végezzük. A gélben lévő pH grádienst közvetlenül az elektrofókuszálás után határozzuk meg, úgy, hogy az anód és katód között egy vonal mentén csíkot vágunk ki a gélből. A csíkokból desztillált vízzel eluáljuk az elektroliteket és a víz pH értékét kombinált üvegelektróddal mérjük meg. Glutaminsav meghatározás A Gla meghatározását HPLC segítségével végezzük "Nucleosii 5SB" oszlopon (Chrompack) Kuwada és munkatársai módszere [Anal. Biochem., 131,173-179. (1983)} szerint. 2. példa Foszfolipidek kötése a Sphérocil-hez A kívánt fószfolipideket kloroformban oldjuk és hozzáadjuk a Sphérocil (Rhone-Poulenc cég gyártmánya) oszloptöltethez a következő arányban: 5 mg foszfolipid/g Sphérocil. A kloroformot nitrogén gázzal távolítjuk el, majd a száraz Sphérocil-foszfolipidet olyan pufferrel mossuk, 5 amelyben előzőleg VAC-t szuszpendáltunk. A VÁC hozzákötődik a Sphérocil-foszfolipidhez Ca2+ és/vagy Mn2 + jelenlétében, ha a foszfolipidek egy része negatív töltésű. 10 3. példa 50 /il citrátos trombocita-mentes plazmát keverünk 200 /ti pufferhez (25 mM triszxHCl 15 (pH = 7,5), 100 mM NaCl), amely kaolint (olyan mesterséges felület, amely a tulajdonképpeni alvadást katalizálja, ez esetben üvegdara), inozitint (foszfolipid forrás) és VAC-t tartalmaz. Ezt a keveréket 3 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd 250 20 Ca2 + -puffert (200 mM triszxHcl (pH = 7,5), 80 mM NaCl, 20 mM CaCl2) adunk hozzá. Az alvadási időt az 1. példában leírt módon határozzuk meg. A táblázat VÁC előállítása marha aorta belhártyából. Összefoglalás Tisztítási lépés Protein“ mg VÁC0 egység egység/mg Specifikus aktivitás Kitermelés % Tisztasági fok 35% (NH4)2S04-os felülúszó 630 19.500 31,0 100 1,0 90% (NH4)2S04-os csapadék 470 19.000 40,4 97 1,3 Hidroxi-apatit frakció-206 17.300 84,0 89 2,7 DEAE-frakció 35,8 13.900 388 71 12,5 139-es Spehadex G100-frakció 0,45 666 1480 3,4 47,7 a) A protein mennyiségi meghatározása Lowry és munkatársai (O.H.Lowry, N.V. Rosebrough, A. L. Farr és R. J. Randall, J. Bioi. Chem., 193.265 /1951/) módszerével történik. b) A VÁC egységek meghatározása az 1. pél 50 dában leírt próba hígítási sorok egylépcsős alvadási vizsgálatával történik. Az a hígítás, amelyben a kontrolihoz (65 másodperc) képest az alvadási idő 100 másodpercre nő, a definíciós szerint 1 VÁC egységet tartalmaz. 10
