199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 drasztikus érfal sérülés vált ki és amelynél a főszfolipidek magas koncentrációban keletkeznek, éppen ezen magas foszfolipid koncentrációk miatt a VÁC nem gátolja. Ezért az elvérzés veszélye VÁC alkalmazása esetén meglepően rendkívül csekély. Minden eddig ismert antikoagulánssal szemben, amelyek egy vagy több alvadási faktort hatástalanná tesznek és ezáltal az elvérzés veszélyét növelik, a VÁC különb tulajdonságokkal rendelkezik! — A VÁC különös módon nem inaktiválja magukat az alvadási faktorokat! Ezáltal az alvadási faktoroknak a továbbiakban is iehlőségük van egyéb feladataikat - amelyekből egyre többet fedeznek fel - betölteni. Néhány aktív alvadási faktornak például fontos, nem hemosztatikus feladata a kemotaxis létrehozása az inflammator sejtek számára. Ezek a sejtek hozzájárulnak a sérült érfal gyógyulásához. Ezt a folyamatot — meglepő módon — nem akadályozza a VÁC! A jelen találmány először írja le egy újfajta osztályát a véralvadásgátló proteineknek, amelyek az alvadási faktorokat nem inaktiválják. Semmiképpen nem korlátozzuk a találmány oltalmi körét a találmány megvilágítását szolgáló példákra és a leírt tulajdonságokra. A szakemberek a leírt eljárások ismeretében minden leleményes teljesítmény nélkül képesek arra, hogy további olyan proteineket állítsanak elő, amelyek véralvadásgátló tulajdonságokat mutatnak fel anélkül, hogy az alvadási faktorokat inaktiválnák. Ezek a proteinek is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak. A találmány leírásában használt rövidítések jelentése a következő: VÁC = vaszkuláris antikoaguláns PFP = trombocita mentes plazma TBS 100 mM NaCl, 50 mM trisz.HCl, pH - “7,5 EDTA = etiién-diamin-tetraecetsav TBSE = TBS 2 mM EDTA-val BTP = marha-agy tromboplasztin HTP humán-agy tromboplasztin TBSA = TBS 0,5 mg/ml humán szérum albuminnal, pH/7,9 S 2337= N-benzoil-L-izoleucil-L-glutamil-L-pipekolil-glicil-L-arginil-p-nitroanilid-dihidroklorid S 2238 = H-D-penilalanil-L-pipekolil-L-arginin-p-nitroanilid-dihidroklorid AT —III humán antitrombin-III S.A. = specifikus aktivitás O^Gro-P-Cho l,2-dioleil-sn-glicero-3-foszfokolin (PC) Ole2Gro-P-Ser l,2-dioleil-sn-glicero-3-foszfoszerin (PS) Gla= 7-karboxi-glutaminsav A véralvadási faktorok nomenklatúráját illetően a "Task Force on Nomenclature of Blood Clotting Zymogens and Zymogen Intermediates" ajánlásait alkalmazzuk. A felhasznált anyagok származása a következő: az analitikai SDS-PAGE, a hidroxi-apatit és HTP a BioRad termékei, a Sephadex G100 és G75, a DEAE-Sephacel és a "Low Molecular Weight Calibration Kit" a Pharmacia cég, az S 2337 és S 2238 kromogén szubsztrátum a KabiVitrum cég és a Diaflo PM 10 ultraszűrő membrán az Amicon cég gyártmánya. Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat. 1. ábra: A VÁC gélszűrése Sephadex G100 oszlopon Az oszlopot (3.80 cm) 60 cm-es nyomómagassággal készítjük el és 500 mM NaCl-t és 20 mM trisz.HCl-t tartalmazó oldattal (pH = 7,5) egyensúlyba hozzuk. A DEAE kromatografálás után kapott VÁC tartalmú frakciót 2 ml-re koncentráljuk és felvisszük a Sephadex GlOO-ra. A 60 cm-es nyomómagasságot tartjuk. Az üres térfogat 245 ml (70 frakció) volt. Ezután 2 ml-enként gyűjtjük a frakciókat. A frakciókat 10% glicerint tartalmazó TBS-ben dializáljuk, s ezután VÁC aktivitásra vizsgáljuk egylépcsős alvadási módszerrel, ahogyan ezt az 1. példában leírjuk. Az alvadási időket a G 100-as frakciók TBS-sel történő 1:10 hígításaivl kapjuk. VÁC távollétében 65 másodperc az alvadási idő. 2. ábra: A VÁC SDS - PAGE analízise Az SDS-PAGE-t Laemmli (U. K. Laemmli, Nature, 227, 680-685. /1970/) szerint végezzük. A gél összetétele: 10% akrilamid, 0,27% N,N3- -metilén-bisz-akrilamid és 0,1% SDS. Az x-tengelyen lévő számok jelentése: 1. standard molekulasúlyú anyagok, amelyekben redukált diszulfidkölések vannak; 2. 25 Mg redukált VÁC; 3. 25 Mg nem redukált VÁC. 3. ábra: A VÁC izoelektromos pH-jának meghatározása Az elektrofókuszált 3,5-9,5 pH tartományban, PAG-lemezekkel végezzük (lásd az 1. példát). 200 Mg humán Hb-t és 20 Mg VAC-t viszünk a gélre, ha abban már kialakult a pH-grádiens. A humán Hb referenicaként szolgál, tekintve, hogy izoelektromos pontja ismert: pH « 6,8. Mielőtt a gélt Coomassie Blue-val megfestjük, 30 percig 0,7 mólos triklórecetsawal fixáljuk. 4, ábra: A VÁC negatív töltésű foszfolipid liposzómához való kötődésének analízise SDS- PAGE-el Az SDS-PAGE-t Laemmli szerint |U. K. Laemmli, Nature, 227, 680 — 685. /1970/] végezzük, ugyanolyan lemezeken, mint amilyeneket a 2. ábránál leírtunk. A vizsgált minták a kötődési kísérletekből származnak, lásd a B táblázat magyarázatánál. Az x-tengelyen lévő számok jelentése: 1. standard-molekulasúlyú anyagok, amelyekben redukált diszulfid-kötések vannak; 2. VAC-készítmény liposzóma nélküli centrifugálásnál kapott felülúszó; 3. VAC-készítmény liposzóma jelenlétében történő ccntrifugálásnál kapott felülúszó, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
