199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 4. VAC-készítmény liposzóma és Ca2 + jelenlétében történő centrifugáiéinál kapott felülúszó, 5. felülúszó, amelyet a 4 alatti liposzóma üledék újbóli szuszpendálása - 10 mM EDTA-t tartalmazó TBS-ben — után végzett cenlrifugálással kapunk. 5. ábra: A VÁC koncentráció hatása a trombin képződés gátlására A VÁC adott koncentrációi a kísérleti rendszerekben meglévő koncentrációk. A trombin képződést a következő reakció-keverékben mérjük: 10 mM CaCl2 tartalmú TBSA-ban 1 /»M protrombin, 10 mM Xa faktor és 0,5 M (A — A) vagy 5 M (•-•) foszfolipid membrán (PC/PS; 4:1 mól/mól). A reakciókeveréket a VÁC (S.A. = 1.300 egység/mg) említett mennyiségeivel 3 percen át 37 °C-on protrombinnal keverjük. A protrombin hozzáadásával indítjuk meg a trombin képződést A keverékben (lásd az 1. példát), s ennek sebességét mérjük. A trombin képződés sebessége VÁC nélkül 3,3 nM IIa/perc (A - A), illetve 10,9 nM II/a/perc (• -•) volt. 6. ábra: A foszfolipid koncentráció hatása a trombin képződés VÁC okozta gátlásra A trombin képződését a következő reakciókeverékben mérjük TBSA-ban 1 ^M protrombin, 10 nM Xa faktor, 10,7 /ig/ml VAC (S.A. = 1.300 egység/mg) és foszfolipid membrán [PC/PS; 4:1 mól/mól] különböző koncentrációkban. Az Xa faktort, VAC-t és foszfolipidet 3 percig 37 °C-on TBSA-ban keverjük. A trombin képződést úgy váltjuk ki, hogy a reakció keverékhez hozzáadjuk a protrombint. A trombin képződés sebességét az 1. példában leírt módon mérjük. A trombin képződés gátlásának százalékos arányát (•—•) minden foszfolipid koncentrációra megadjuk a VÁC nélkül végbemenő trombin képződés sebességére (A — A ) vonatkoztatva. 7. ábra: Köldökzsinór homogenizátum 10.000 g-vel való centrifugáiása után kapott felülúszó gélszűrése Sephadex G 100-on Egy 10.000 g-vel kapott felülúszó 2 ml-ét TBS-el előzőleg kiegyensúlyozott Sephadex G100 oszlopra (1,5x80 cm) visszük fel. Az oszlopot TBS-sel eluáljuk. A kapott frakciók alikvot mennyiségeit MPTT-vel vizsgáljuk. Bizonyos frakciók ( ) prokoaguláns aktivitást mutatnak és az MPTT meghatározásban megindítjuk az aivadást. HTP, Xa faktor vagy trombin hozzáadása nélkül. Más frakciók ( ) meghosszabbítják az alvadási időt az MPTT meghatározásban, ha az alvadást HTP-vel indítjuk meg. Ezeket a frakciókat összegyűjtjük és tovább frakcionáljuk. 8. ábra: Az antikoagulánsok kromatografálása DEAE-Sephacel-en [A] és Sephadex G75-ön [B] A Sephadex G100 oszlopról gyűjtött antikoagulánst tartalmazó poolt DEAE-Sephacel-re visszük. Az eluciót lineáris NaCl grádiensben — 50 mM -* 300 mM NaCl (—) — végezzük és 4 ml-es frakciókat szedünk, adszorpciójukat 280 nm-en mérjük (--------), antikoagulánc aktivitásukat MPTT-vel vizsgáljuk, ahol HTP-t használunk (végkoncentráció 95 /tg protein/ml) az alvadás megindításához. Az antikoaguláns aktivitású frakciókat összegyűjtjük, koncentráljuk, majd Sephadex G75-re (B) visszük fel. 2 ml-es frakciókat gyűjtünk, ezek abszorpcióját 280 nm-en (--------) mérjük és antikoaguláns aktivitásukat (•) ellenőrizzük. V0-al jelöljük az oszlop ürestérfogatát. 9. ábra: Az antikoagulánsok dózis-függése az MPTT-ben MPTT meghatározásnál különböző antikoaguláns mennyiségeket adunk a reakcióhoz. Az alvadást HTP-vel (végkoncentráció 95 /tg protein/ml) indítjuk meg. A kontroll alvadási idő 65 másodperc. 10. ábra: A Sephadex G75-eluátum különböző frakcióinak gélelektroforézise A G75-eluátum különböző frakcióinak egy meghatározott mennyiségét gél-elektroforézissel vizsgáljuk, ahogyan ezt leírtuk. A géleket ezüsttel festjük Merril és munkatársai [C.R. Merril, D. Goldman és M.L. van Keuren, Electrophoresis, 3, 17 — 23. /1982/] szerint. 1 sáv: redukált, alacsony molekulasúlyú standardok; 2—6 sáv: a 35, 39, 41, 43 és 50-es számú G75-frakciók redukálásán alikvot mennyiségei. 11. ábra: Proteolitikus enzimek hatása az antikoaguláns aktivitásra Az antikoagulánst 37 °C-on I típusú proteázzal ( , végkoncentráció 0,11 egység/ml), tripszinnel (A, végkoncentráció 88 BAEE egység/ /ml) és proteolitikus enzim nélkül (•) inkubáljuk. A reakció keverékekből az adott időpontokban 5 fi\, 6 /tg antikoaguláns proteint tartalmazó mintái veszünk és hozzáadjuk MPTT-hez. Az alvadást HTP-vel indítjuk meg (végkoncentráció 18 /ig protein/ml). A kontroll alvadási idő 110 másodperc volt. A proteolitikus enzimek egységeit a gyártók adatai alapján adjuk meg. 12. ábra: A vaszkuláris antikoaguláns hatása az alvadási időre, amelyet MPTT-ben HTP-vel vagy Xa faktorral vagy trombinnal indukálunk Az alvadást megindító anyagok koncentrációit (HTP= 18 /ig protein/ml; Xa faktor* 1,5 nM, trombin = 0,4 nM) úgy választjuk meg, hogy a kontroll alvadási idő körülbelül 110 másodperc legyen (üres hasábok). Xa faktor alkalmazása esetén a reakció keverékhez foszfolipid vezikulákat adunk (végkoncentráció: 10 /iM). A foszfolipid O^Gro-P-Ser/O^Gro-P-Cho 20:80 mólarányú összetételéből áll. Az alvadási időket, amelyeket az említett anyagokkal 3,5 /tg antikoaguláns protein jelenlétében kapunk, a sraffozott hasábokkal ábrázoljuk. 13. ábra: Az antikoaguláns hatása a protrombin aktiválására, ha ezt ÍXa, Va, foszfolipid, C2 + ), (Xa, foszfolipid, C2 + ) és (Xa, Ca2 + ) indukálja 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
