199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 centráció mellett kisebb. A találmány szerinti proteinek nem hidrotizálják a foszfolipidekot. A találmány tárgyát képezd véralvadásgátló 5rőtéinek az alvadási faktorokat nem inaktiválik és amelyek kétértékű kationokon, a Ca2 + és/vagy Mnï+ ionon keresztül a negatív töltésű foszfolipidcket — ezek például vezikulákban, liposzómákban és eteroszómákban találhatók - megkötik és/vagy megkötik kétértékű Ca2 + és ionon keresztül a Spherocillel összekapcsolt negatív töltésű foszfolipideket. E proteinek és a negatív töltésű foszfolipidek közti kötés reverzibilis és etiién-diamin-tetraecetsawal (DEAE) felbontható. A találmány szerinti proteinek képesek arra, hogy a Xa faktort és a protrombint negatív töltésű foszfolipid felületről kiszorítsák. A találmány tárgyát képező véralvadásgátló proteinek, amelyek a véralvadási faktorokat nem inakiiválják, molekulatömege körülbelül 70xl()3, 60xl()3, 34xl03 és 32x10 , amelyek közül a 34xl03, illetve a 32xl03 molekulatömegű protein mindenkor csak egyetlen polipeptid láncból áll. A találmány tárgyát képezd véralvadásgátló proteinek az alvadási faktorokat nem gátolják, és a következőkkel jellemezhetők: — emlősállatok érfalából izolálhatjuk, majd tisztítjuk őket,- nem glükoproteinek, — nem foszfolipázok, — izoelektromos pontjuk pH 4,4-4,6 közé esik, — a véralvadásgátló proteinek aktivitását a tripszin és/vagy a kimotripszin teljesen nem rontja le, — a véralvadásgátló proteinek aktivitását a kollagenáz és/vagy elasztáz nem befolyásolja, — a kétértékű C’a2+ és Mn2+ kationon keresztül megkötik a negatív töltésű foszfolipideket, amelyek vezikulákban, liposzómákban és eteroszómákban fordulnak elő, — a kétértékű Ca2+ és Mr + ionon keresztül megkötik azokat a negatív töltésű foszfolipideket, amelyek Sphérocilhez vannak kapcsolva, — e proteinek és a negatív töltésű foszfolipidek közti kötés reverzibilis és EDTA-val felbontható, — a Xa faktort és a protrombint kiszorítják a negatív töltésű foszfolipidek felületéről, — gátolják a módosított trombin-idő meghatározást, — gátolják a módosított, aktivált parciális tromboplasztin-idő meghatározást, — gátolják a nem módosított protrombin-idő meghatározást, — gátolják a negatív töltésű foszfolipidek és Ca2 + ionok jelenlétében a Xa alvadási faktor által megindított protrombin aktiválódást,- nem gátolják a Xa és Ha faktorok biológiai és amidolitikus aktivitását,- in vitro gátolják a X faktor intrinsic aktiválódását, amelyet a IX, faktor idéz elő negatív töltésű foszfolipidek és Ca2+ ionok jelenlétében,- in vitro gátolják a protrombin aktiválódását, amelyet izolált, stimulált trombociták indukálnak,- in vitro gátolják az érfal által indukált alvadást és- a proteinek által indukált protrombin aktiválódás gátlás (az aktiválódást a Xa faktor váltja ki) és foszfolipid koncentrációtól függ, és nagy foszfolipid koncentráció mellett a gátlás kisebb. A találmány tárgyát a fenti olyan VAC-proteinek előállítása képezi, amelyek lényegében mentesek mindenfajta állati szövettől és amelyeket előnyösen tiszta formában állítunk elő. A VAC-proteinek izolálásához alkalmas kiindulási anyagok a következők: érfal, különböző emlősökből, például szarvasmarhából, patkányból, lóból és emberből származó erekkel erősen behálózott szövetek, valamint ezen emlósok endotál-sejttenyészetei. Különösen alkalmasak a marhából, patkányból, lóból származó és emberi artéria falak, valamint a humán köldökzsinór-véna és -artéria. A találmány tárgyát képező eljárás, amellyel a találmány szerinti proteineket előállítjuk, tulajdonképpen ismert izolálási és tisztítási módszerekből áll. Különösen alkalmas erre az alábbi eljárás, amelynek sémája a következő: A homogenizált kiindulási anyagot először differenciál-centrifugában centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot ezután - tetszés szerinti sorrendben egymás után — a következőképpen kezeljük. Ammóniumszulfátlal kicsapjuk a nemkívánt alkotórészeket. A felülúszót ezután affinitás-kromalográfiával - például hidroxi-apatiton — , molekulaszűrőn való kromatográfiával — például Sephadex G10()-on - és immunadszorpciós-kromatográfiával — például poliklonális antitestek segítségével — tovább tisztítjuk. A mindenkori kiindulási anyag minősége szerint változtathatjuk ezt a tisztítási sémát vagy más tisztítási módszereket is alkalmazhatunk, például a foszfolipid vezikulák segítségével való tisztítást. A klasszikus antitrombotikus kezelés, az orális alvadás gátlás mellett legújabban - látható tünetekkel járó trombózis esetén — bioszintetikus szövet-plazminogén-aktivátort alkalmaznak intravaszkulárisan [N. Engl. J. Med., 310, 609-— 613. /1984/ J. A találmány szerinti proteinek kiválóan alkalmasak arra, hogy például műtéteknél megelőzzék a trombózis kialakulását különösen véralvadásgátló tulajdonságaik révén, s ezzel egyidejűleg az alvadásfüggő trombocita-aggregáció gátlásával. A találmány a fentiek alapján tehát a találmány szerinti proteineknek, mint antitrombotikus szereknek az alkalmazására is vonatkozik. A találmány további tárgyát képezik azok a gyógyszerkészítmények is, amelyek legalább egy találmány szerinti proteint tartalmaznak. A VÁC szarvasmarha aortából történő izolálásának és tisztításának eredményeit az A táblázatban mutatjuk be. A VAC-aktivitás mennyiségi meghatározási a 100.000 g-vel való centrifugá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
