199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 Iáikor nyert felülúszóból értékelhetetlen volt prokoaguiáns aktivitás jelenléte miatt.Az ezen aktivitásért felelős alkotórészt ammóniumszulfáttal, 35%-os telítés mellett, csapjuk ki. Megállapítottuk, hogy a fenti oldat 35%-os ammónium-szuifátos kicsapás után 100% VAC-aktivitást tartalmaz. Az oldatot úgy koncentráljuk, hogy 90%-ra telítjük ammóniumszulfáttal, majd a VÁC proteineket tartalmazó csapadékot TBS jelenlétében hidroxi-apatit oszlopon kötjük meg. Mosás után az oszlopról a VÁC proteineket növekvő foszfát-grádienssel eluáljuk. Ezután alacsony ionerősség mellett DEAE-Sephacel oszlopra kötjük a VÁC proteineket. Az oszlopról a VÁC proteineket csökkenő nátrium-klorid koncentráció-grádienssel eluáljuk. A végső tisztítás abból áll, hogy a proteineket molekulasúlyuk szerint választjuk el Sephadex Gl00-on, gélszűréssel. Az eluáló folyadék nagy sótartalmú puffer, hogy a VÁC és a Sephadex anyagának kölcsönhatását a minimálisra szorítsuk. A VÁC erről az oszlopról az oszlop üres-volumenének 1,6- szoros mennyiségében eluálódik (lásd az 1. ábrát). Ezután a végső tisztítási lépés után a VÁC- aktivitás össz-kitermelése 35%-os. Az SDSPAGE (nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamidgél-elektroforézis) szerint minden olyan G100 frakció, amely VAC-aktivitást mutat, két polipeptidet (molekulasúlyuk 34.000, illetve 32.000) tartalmaz. Egyes esetekben a 60.000-es molekulasúlyú frakció is mutatott VAC-aktivitást. Az SDS-PAGE szerint csak a 138 — 140. csúcsfrakciók homogének a két polipcptidre vonatkozóan. A szarvasmarha aortából történő tisztítás adatait az A táblázat foglalja össze. A két polipcptidre vonatkozóan homogén G100 frakciókat használjuk ezen leírásban szereplő minden további kísérlethez, kivéve azt a kísérletet, amelyet a VAC-nak a foszfolipid liposzómához való kötődése jellemzésére végzünk. A 139-es G100 frakcióban a VAC-aktivitás 3,4%-a volt kimutatható, 1.480 egység/mg protein specifikus aktivitással, ahogy ezt az egylépcsős alvadási vizsgálatban megállapítottuk. Ez a frakció nem tartalmazott kimutatható mennyiségű foszfolipidet és a 280 nm-nél mért abszorpcióból és a protein tartalomból számítva, ezen tisztított VAC-proparátum extinkciós-koeficiense A,%lcm » 8,5 értéket adott. A VÁC jellemzése A 2. ábrából kitűnik, hogy a tisztított protein-anyag két polipeptidet tartalmaz, 34.000 és 32.000 molekulasúllyal - ezeknek tulajdonítható a VÁC aktivitás - és e proteinek egyetlen láncból állnak. Bázikus fukszinos Schiff-reagensscl megállapítható, hogy a két protein kevés szénhidrát csoportot tartalmaz. Ezenkívül egyik proteinben sem mutatható ki Gla-csoport. Az izoelektromos fókuszálásnál mindkét protein egyetlen sávként vándorol, s ez 4,4-4,6 izoelektromos pontnak felel meg (lásd a 3. ábrát). A PAG-lemezen (poliakrilamid) lévő gélből eluált sávból kapjuk meg a VÁC aktivitást. Az eluálum SDS-PAGE analízise mindkét protein jelenlétét újból kimutatta. így megállapítható, hogy mindkét protein egyetlen sávként vándorol a PAG-lemez pH-grádiensében. A módszer ellenőrzése érdekében humán hemoglobint (Hb) vizsgáltunk ugyancsak izoelektromos fókuszálás segítségével. A kapott 6,8-as érték az irodalmi adattal egyezett (lásd a 3. ábrát). Kötési kísérletekkel kimutatható, hogy a VAC-aktivitás negatív töltésű foszfolipid-membránokhoz képes kötődni. A kötődés Ca2+ és Mn2+ ionok jelenlétében jön létre, de Mg2 + ion jelenlétében és kétértékű fémionok (lásd a D táblázatot) távollétében nem. A VAC-aktivitásnak a liposzómákhoz való kötődése megfordítható reakció és EDTA reagenssel felbontható. SDS-PAGE-el kimutattuk, hogy mindkét protein Ca2 + ion jelenlétében kötődhet liposzómákhoz és hogy e kötés EDTA hozzáadásakor diszszociál (lásd a 4. ábrát); ez egy újabb adat arra nézve, hogy a VAC-aktivitás e két proteinnek tulajdonítható. 10% glicerint tartalmazó TBS-ben tartva —70 °C-on a VAC-aktivitás legalább 3 hónapig stabil, 0 °C-on legalább 12 órán át és 37 °C-on legalább fél óra hosszat stabil, 56 °C-on az aktivitás 2 percen belül eltűnik. A VÁC hatása Az egylépcsős koagulációs vizsgálatban, ahol az alvadási a BTP indítja meg, a VÁC meghoszszabbítja az alvadási időt. Ha ebben a vizsgálatban a BTP-t tisztított marha trombinnal vagy tisztított marha Xa faktorral helyettesítjük, azt látjuk, hogy a VÁC az alvadási időt csak meghosszabbítja, ha az Xa faktort a koaguláció megindítására használjuk, továbbá, hogy a trombin által indukált alvadási a VÁC nem befolyásolja. Ez arra mutat, hogy a VÁC az X„ faktor aktivitását közvetlenül gátolja, vagy hogy a protrombináz-komplex-szel kölcsönhatásba lép. További bizonyításhoz az amidolitikus trombin-képződési vizsgálatot használjuk, amelyet tisztított marha Xa faktorral és protrombinnal végzünk. Az 5. ábrán bemutatjuk, hogy ha a protrombinnak az Xa faktor által történő aktivitása trombinná Ca2 + és foszfolipid jelenlétében megy végbe, a VAC a protrombin aktiválódását gátolja és hogy a gátlás mértéke függ a VÁC koncentrációjától. Ezenkívül a VÁC gátló hatása alacsonyabb foszfolipid koncentráció mellett erősebb. A 6. ábra a protrombin aktiválás VÁC által indukált gátlásának foszfolipid-függését ábrázolja. Megemlítendő, hogy nulla foszfolipid koncentrációnál az Xa faktor általi trombin aktiválást nem gátolja a VÁC. A kontroll vizsgálatok azt mutatják, hogy maga a VÁC nem befolyásolja a mérési rendszert. Ha 5 /íM foszfolipidet [PS/PC; 1:4 mól/mól] 107 /tg/inl VÁC (specifikus aktivitás/ 1.300 egység/mg) és 10 mM Ca2+ keverékével inkubálunk, akkor 37 *C-on 3 percen belül csökken a prokoaguláns-aktivitás. Ez azt mutatja, hogy a VAC-nak nincs foszfolipáz aktivitása. Az At-lII-al ellentétben a VÁC nem befolyásolja a tisztított trombin amidolitikus aktivitását 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
