199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 rozására az MPTT vizsgálat, mint "quantitativ assay" szolgál (9. ábra). Egy egység antikoaguláns aktivitás az a mennyiség, amely az MPTT vizsgálatban - ahol HTP-t használunk az alvadás kiváltására (végkoncentráció 95 ng protein/ /ml) - az alvadni időt, a 65 másodperces kontroll időhöz képest 100 másodpercre növeli meg. Ennek az assay-nek a segítségével kiszámítottuk, hogy 10 g nedves artéria-szövetből mintegy 2 mg protein termelhető, közel 1200 egység antikoaguláns aktivitással. Módosított protrombin-idő meghatározás (MPTT) Módosított protrombin idő meghatározást (MPTT) a következőképpen végezzük: szilikonozott üvegküvettában 37 °C hőmérsékleten 50 /il PFP-t keverünk össze 150 /d TBS-el, 25 /ill rutin HTP-hígítással és 25 /il TBS-el (kontroll), vagy a homogenizált artéria-anyag egy frakciójának 25 /il-ével. Három perces inkubálás után az alvadást 250 /»I Ca2 +-puffer (80 mM NaCl, 20 mM CaCl2 és 10 mM triszxHCl /pH = 7,9/) hozzáadásával indítjuk meg. A fibrin képződést "Payton Dual Aggregation Module" [ G. Hornstra, Phil. Trans. R. Soc. London B, 294, 355 — 371. /1981/j segítségével regisztráljuk. Amennyiben az MPTT meghatározásában az alvadás megindításához Xa faktort használunk, a HTP-t elhagyjuk és a hígított PFP-hez 25 /il tisztított faktort adunk 250 /il Ca2 + -pufferrel együtt. Módosított trombin-idő meghatározás (MTT) A módosított trombin-idő meghatározást (MTT) a fent leírtakkal azonos módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy a Xa készítményt 25 /il tisztított trombinnaí helyettesítjük. Proteinek Az I típusú proteáz és a tripszin (EC 3.4.2.1.4) a Sigma cégtől származik. A HTP-t Van Dam-Mieras és munkatársai [M.C.E. van Dem-Mieras, A.D. Muller, G. van Dieijen és H.C. Hemker, Methods of Enzymatic Analysis, 5. kötet, 352 - 365. oldal; Verlag Chemie GmbH, Weinheim, NSZK /1984/] módszerével állítjuk elő, emberi agyból. A X„ faktort protrombint és trombint citrátos marhavérből izoláljuk és tisztítjuk Rosing és munkatársai módszerével [J. Rosing, G. Trans, J.W.P. Govers-Riemslag, R.F.A. Zwaal és H.C. Hemker, J. Biol. Chem., 255. 274—283 /1980/J. Az V faktort marhavérből állítjuk elő Lindhout és munkatársai szerint (T. Lindhout, J.G. Gosevrs — Riemslag, J. P. Waart, H.C. van de Hemker és F.Rosing, Biochemistry, 21, 4594-5502 /1982/j. Az V, faktort úgy kapjuk, Hogy az V faktort trombinnaí inkubáljuk (lásd Lindhout és munkatársai idézett közleményét). A protrombin koncentráció számításánál a következő adatokat használjuk: Mr- 72.000 és A1%,280** 15,5 [W.G.Owen, C. T. Esmon és C.M. Jackson, J. Bioi. Chem., 249, 594 - 605 /1974/); az V faktor koncentrációjának számításakor pedig a következőket: Mr=» 330.000 és A1%28o- 9,6 (E.M.Ncsheim, K.H.Myrmel, L.Hibbard és K.G. Mann, J. Bioi. Chem., 254, 508-517.119191). A X, faktor és a trombin koncentrációját az aktív helyek titrálásával (lásd Rosing és munkatársai idézett közleményét) határozzuk meg. A többi protein koncentrációját Lowry és munkatársai módszerével (lásd fent) határozzuk meg. Foszfolipidek és foszfolipid-vezikulák előállítása Az 01e2Gro-P-Cho és 01e2Gro-P-Ser készítményeket Rosing és munkatársai (lásd a fent idézett közleményben) szerint állítjuk elő. E készítményekből néhány kétrétegű vezikulát állítunk elő ultrahanggal (20:80 mólarányú 01e2Gro-P-Cho és Ole2Gro-P-Ser) Rosing és munkatársai szerint (lásd a fenti közleményt). A foszfolipid koncentrációkat a Böttcher-féle (lásd a fent idézett közleményben) foszfát-analízissel határozzuk meg. A protrombin aktiválás mérése A protrombin aktiválás időbeli lefolyását az alvadásgátló különböző koncentrációival vizsgáljuk. A következő keveréket: (Xa, Ca2 + ), (Xa, foszfolipid, Ca2 + ) vagy (Xa, VB, foszfolipid, Ca2 + ) az alvadásgátló különböző mennyiségeivel keverjük 37 °C-on, 50 mM triszxHCl, 175 mM NaCl és 0,5 mg/ml humán szérum albumin tartalmú oldatban (pH= 7,9); 3 perc múlva protrombin hozzáadásával indítjuk meg a reakciót. A reakciókeverékből különböző időközönként 25 /tl-es mintákat veszünk, amelyeket 37°C- on tartott küvettákba viszünk át. A küvetták TBS-t, 2 mM EDTA-t és 0,23 mM S 2238 szubsztrátumot tartalmaznak (az összmennyiség végül 1 ml lesz). Az abszorpció változásokat 405 nm-en, Uvikon 810 spektrofotométerben mérjük, s egy standard görbe segítségével, amelyet ismert mennyiségű tisztított trombinnaí vettünk fel, kiszámítjuk a különböző alvadásgátló koncentrációknál képződött trombin mennyiségét. A foszfolipidet 20:80 mólarányú 01e2Gro-P-Ser és 01e2Gro-P-Cho vezikulaként adjuk a reakciókeverékhez. Jellemzők A Sephadex G75-el végzett kromatografálás különböző frakcióit MPTT-vel vizsgáltuk és SDS-PAGE analízist is végeztünk. Az eredmények azt mulatják (lásd a 10. ábrát), hogy az alvadásgátló molekula súlya 32.000. Az antikoaguláns aktivitás és a 32K-sáv közti összefüggést úgy állapítottuk meg, hogy a poliakrilamid gélből csíkokat vágtunk, s ezekből a proteineket 0,5 mg/ml marhaszérum albumin tartalmú TBS-el oldottuk ki. Csak abban a csíkban volt antikoaguláns aktivitás, amely a 32K-sávnak felelt meg. Ezenkívül kimutattuk, hogy ez az aktivitás 56°C- on termolabilis, és ugyanaz a dózis ugyanolyan hatást fejt ki az MPTT vizsgálatban, mint a kiindulási anyag. Azokat a Sephadex G75 frakciókat, amelyekben a legnagyobb volt az alvadásgátló aktivitás, egyesítettük és az alvadásgátló szer további ismertetőjegyeinek vizsgálatára használtuk fel. Ha az alvadásgátló anyagot 56 °C-on inkubáljuk, úgy aktivitása gyorsan csökken és 2 perc múlva már nem mérhető (lásd a 16. ábrát). Az alvadásgátló teljesen elveszti aktivitását 2 órán belül, ha I típusú proteázzal inkubáljuk, ezzel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
